Практическая работа № 6

Тема: «Количественное определение пировиноградной кислоты колориметрическим методом (по Умбрайту)»

Пировиноградная кислота- один из главных метоболитов промежуточного обмена веществ. Содержание пирувата в крови здорового человека- 0,4-1,2 мг в децилитре крови, в моче- 10-25 в сутки. Повышенное содержание пирувата токсично для организма!

Материал исследования: моча, сыворотка крови.

Реактивы: 2.4- динитрофенилгидразин, 1% р-р в концентрированной соляной кислоте, толуол, гидроксид калия, спиртовой 2,5% р-р, пируват, стандартный р-р (6.25 мг в 100 мл воды).

Оборудование: штатив с сухими пробирками, мерный цилиндр 10 мл, мерные пипетки 1-2 мл с грушей, корковые пробки, обернутые фольгой, ФЭК, кюветы, с рабочей шириной 1 см.

Ход работы:

1. Готовят 3 пробирки. В первую (опытную) приливают 1 мл мочи ( или 1 мл сыворотки), в две другие ( контрольные) приливают по 1 мл дистиллированной воды. Во все 3 пробирки добавляют по 0.5 мл 0.1 % р-ра 2.4-динитрофенилгидрозина ( осторожно, концентрированная соляная кислота!!!), перемешивают и оставляют стоять на 5 мин.

2. По истечении этого времени прибавляют с помощью мерного цилиндра по 3 мл толулола в каждую пробирку. Пробирки закрывают пробками , обернутыми в фольгу, встряхивают в течении 3-х мин и оставляют на столе на 2 мин до четкого появления двух фаз: нижняя- вода, верхняя- толуол. Верхний слой отсасывают пипеткой с резиновым колпачком в несколько приемов и переносят в сухую пробирку.

3. Из собранной жидкости мерной пипеткой отбирают точно 1 мл и переносят в сухую пробирку. Точно также поступают и с двумя контрольными пробами. К содержимому всех трех пробирок приливают по 2 мл спиртового р-ра гидроксида калия с помощью мерного цилиндра. Спустя 10 мин пробы колориметрируют на ФЭКе со светофильтром № 4 в кюветах с толщиной слоя 1 см.

Расчет: Содержание пирувата в пробе определяют по калибровочному графику, а затем для мочи пересчитывают на суточный диурез( умножают на 1500), получая ответ в мг на 1500 мл. Если работу выполняли с сывороткой, производят расчет на 1 л сыворотки. Расчет проводят по формуле х= а*3*1500, где а- содержание пирувата в пробе, мкг; 3- разведение; 1500- суточный диурез.

Оформление работы: В протокол заносят принцип метода, клиническое значение определения пирувата и полученный ответ.

Практическая работа № 7

Тема: Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте.

Цель: изучения влияния слюны, желудочного сока и пакреатина на полисахариды пищи: крахмал и целлюлозу.

Материал исследования: крахмал, 1% р-р; целлюлоза , 1% водная суспензия.

Реактивы: желудочный сок; панкреатин, 5% р-р; слюна; сульфат меди, 1% р-р; гидроксид натрия, 10% р-р.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, бюретки, термостат ( 37 С), газовая горелка.

Ход работы:

Готовят пробы соответственно таблице:

№ пробы	Р-р крахмала, мл	Суспензия целлюлозы, мл	Слюна, мл	Желудочный сок, мл	Панкреатин, мл
1 2 3 4 5 6 7 8	1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ----	---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0	1.0 1.0 ---- ---- 1.0 1.0 ---- ----	---- ---- 1.0 1.0 1.0 1.0 ---- ----	---- ---- ---- ---- ---- ---- 2.0 2.0

Для инкубации пробирки помещают в термостат на 30 мин. После инкубации содержимое каждой пробирки анализирует на присутствие продуктов расщепления полисахарида с помощью реакции Троммера. Для этого в каждую из восьми пробирок добавляют 10% р-ра гидроксида натрия и по 5 капель 1% сульфата меди. Осторожно нагревают верхнюю часть р-ра в пробирке до закипания на газовой горелке и кипятят в течении 1 мин. Появление красного осадка оксида меди (I) указывает на положительную реакцию Троммера в присутствии глюкозы и мальтозы.

Оформление работы: Результаты опыта оформляют в виде таблицы:

Номер пробы	Субстрат	Обнаружение продуктов реакции	Фермент, расщепляющий углеводы	Источники фермента	Отдел ЖКТ	Объяснение результатов

Тема: «Открытие молочной кислоты в желудочном соке.»

Реакция Уффельмана:

В пробирку наливают 10-15 капель реактива Уффельмана, приливают равный объем дистиллированной воды и добавляют 3-5 капель желудочного сока. В присутствии молочной кислоты фиолетовое окрашивание реактива Уффельмана переходит в зеленовато-желтое.

Тема: «Использование фосфорной кислоты в процессе брожения.»