6.6. Масс-спектрометрия и хромато-масс-спектрометрия

Принцип масс-спектрометрии заключается в ионизации молекул органических веществ под воздействием различных факторов (электронного удара, высокочастотного искрового разряда, химической ионизации и др.) при сохранении основной молекулярной структуры. Образующиеся при распаде возбужденных молекулярных ионов фрагменты разделяются в масс-спектрометре на пучки, содержащие заряженные частицы определенной массы и энергии, и регистрируются в виде соответствующих масс- спектров. Наиболее распространенным в нашей стране является магнитный масс-спектрометр типа МИ-1201. Прибор предназначен для дискретного анализа изотопного состава газов и паров твердых веществ, а также для контроля изотопного состава газовых смесей в промышленных условиях. Порог чувствительности по цезию 5·10^-10 г/л, суммарная погрешность 0,1 %.

Хромато-масс–спектрометрия (ХМС) – масс-спектральный анализ с предварительным хроматографическим разделением соединений и последующим масс–спектрометрическим детектированием.

Основной принцип хромато-масс-спектрометрии состоит в хроматографическом разделении определяемых соединений, их ионизация и детектирование ионов по величине отношения массы к заряду, которая осуществляется в масс-спектрометре. Как правило, в хромато-масс-спектрометрах используются серийные газовые хроматографы с капиллярными колонками. При этом разделение смеси веществ осуществляется методом газовой хроматографии, а масс-спектрометр выполняет роль высокоэффективного детектора.

После хроматографического разделения молекулы ионизируются в вакууме или в атмосфере инертного газа. И чаще всего используют ионные источники, в которых определяемое вещество ионизируется под действием пучка электронов, испускаемых раскаленным рениевым или вольфрамовым нитевидным катодом и ускоряющихся в электрическом поле. Применяют также химическую ионизацию.

Из имеющихся аналитических методов ХМС-анализ является наиболее универсальным. Его преимущества: высокая чувствительность, селективность детектирования, получение информации о структуре вещества.

Контроль пиков молекулярных и фрагментных ионов возможен только с помощью ЭВМ с соответствующим программным обеспечением. Применение вычислительной техники в ХМС-анализе делают исследования менее трудоёмкими и более дешевыми.

Данный метод применяется для анализа супертоксикантов, в том числе диоксинов. Выпускаются хромато-масс-спектрометр марки МХ-132.

6.7. Биологические методы оценки экологической ситуации

Сточные воды могут быть загрязнены различными химическими веществами. Одновременное присутствие в них фенолов, тяжелых металлов, нефтепродуктов и других веществ создаёт значительные трудности при контроле загрязнения и оценки качества. Однако эта задача успешно решается с помощью методов, позволяющих оценить опасность химических веществ на основе наблюдений и экспериментов с водными организмами, жизнедеятельность которых нарушается в токсической среде. Вывод о присутствии в водной среде токсических веществ по показателям биологических реакций живых организмов получил название биологического теста. Под этим термином подразумевают опыт, в котором используют «чистую культуру» какого-либо вида гидробионтов и изучают его реакцию на добавление токсиканта по изменениям какого-либо характерного измеренного показателя, который интегрально отражает нарушение важных жизненных функций. К этим функциям относятся выделение и поглощение кислорода, ассимиляция или поглощение углекислоты, уменьшение или повышение интенсивности биологического свечения, темп роста, плодовитость и другие проявления жизнедеятельности организма. Достоверное измерение этих показателей по сравнению с контрольным опытом свидетельствует о токсическом действии или указывает на присутствие его в окружающей среде, а также на глубину этого действия.

Методы биологической индикации токсичности подразделяют на биофизические, микробиологические, эколого физиологические, биохимические тесты на водорослях и на животных.

Биофизические тесты основаны на количественной оценке таких показателей, как биологическое свечение и электрическая активность органов и клеток. Тест по определению интенсивности свечения основан на свойстве некоторых бактерий светиться в темноте. Под действием токсических факторов свечение угасает, интенсивность его соответственно снижается и может быть замерена фотометрическическим методом. Градиент свечения пропорционален концентрации токсиканта. Электрическую активность органов и тканей гидробионтов, а также её изменения под влиянием токсикантов учитывают с помощью электродов-накладных и вводимых внутрь соответствующих органов.

Микробиологические тесты основаны на способности микроорганизмов расти (или прекращать рост) на средах, содержащих те или иные концентрации токсикантов. Например, выделенные методом тонкослойной хроматографии фунгициды можно обнаружить по их способности замедлять рост микроорганизмов, например грибов. Для этой цели пластинку для тонкослойной хроматографии накладывают на культуральную среду соответствующих грибов и инкубируют в течение определенного времени, затем в культуре грибов отмечают признаки замедления роста.

Эколого-физиологические тесты на различных водных животных основаны на определении выживаемости гидробионтов, интенсивности газообмена, сердечного ритма у дафний, моллюсков, рыб; темпа роста рыб.

Биохимические тесты включают такие показатели, как содержание сахара в крови, соотношение фракций альбуминов и глобулинов в крови, накопление гликогена, активность холинэстеразы в крови и в мозге, активность ферментов и др.

Биологические тесты на водорослях. Многие токсические вещества могут значительно нарушать жизнедеятельность водорослей. Последствия токсического воздействия веществ могут выражаться в морфологических сдвигах, возрастании и снижении фотосинтетической продукции кислорода, темпа клеточного деления и других биологических процессов.

Морфологические (формообразующие) тесты. Визуальное изменение нитчатых водорослей в токсической среде могут выражаться в изменении их окраски с постепенным переходом её от зелёной к желтой, бурой, коричневой или полному обесцвечиванию. Если вещество обладает тенденцией угнетать фотосинтез водорослей, то в тест культуре исчезают пузырьки кислорода, и комок водорослей оседает на дно. Вещества, стимулирующие фотосинтез, вызывают большое количество пузырьков и всплывание комка водорослей. Стимуляторы могут вызывать также бурный рост культуры, её интенсивное позеленение. Завершающим этапом разрушения тест культуры является её лизис (органическая масса исчезает, а вода окрашивается выделяющимися пигментами в желтый, коричневый или бурый цвет).

Учет живых и мертвых клеток в культурах водорослей. Появление мертвых и отмирающих клеток является характерным признаком интоксикации тест культуры и может быть учтено с помощью красителей или люминесцентной микроскопии. Мертвые клетки хорошо окрашиваются 0,1 % -раствором нейтрального красного в красный цвет. Люминесцентная микроскопия основана на свойстве живых и мертвых клеток светиться в УФ-свете разным цветом: мертвые – зеленым, живые – ярко-красным, отравленные клетки – розовым. Соотношение тест культур устанавливается путём подсчета процентного соотношения клеток трёх типов.

Учет интенсивности газообмена водорослей. Эти тесты определяют концентрации токсиканта по результатам снижения интенсивности выделения кислорода и его потребления на дыхательные процессы. Для выяснения того ингибирует или стимулирует исследуемая вода фотосинтетическую деятельность растительных тест объектов достаточно проделать очень простой опыт: поместить ниточку зелёной водоросли в каплю исследуемой воды, покрыть покровным стеклом и выставить на солнечный свет. Если под стеклом не образуется пузырьков, то это свидетельствует о наличии веществ, тормозящих фотосинтез. Наоборот интенсивное газообразование является указанием на присутствие стимулирующих веществ. Тесты, основанные на учете интенсивности выделения кислорода, имеют общий принцип постановки: пробу разбавляют исследуемой водой (в соотношении 1:1, 1:2, 1:5 и т. др.) и определяют кислород. Пробы выставляют на экспозицию при освещении лампами дневного света на 6-8 час, затем во всех пробах определяют содержание кислорода. Разница между конечной и начальной концентрациями кислорода характеризует его прирост, а отношение между величинами прироста в исследуемой пробе и в контрольном опыте указывает на степень подавления или стимулирования фотосинтеза культуры.

Биологические тесты на водных животных. Водные животные представляют более доступный и удобный для изучения тест-объект, чем микроорганизмы, растения, фитопланктон и другие объекты, работа с которыми требует специальных знаний. В качестве тест объектов могут быть использованы простейшие, черви, коловратки, ракообразные, насекомые, моллюски, рыбы. Метод установления смертности гидробионтов считают наиболее понятным и доказательным индикатором токсичности водной среды.

Для выявления самого факта токсичности водной среды и указания на необходимость поиска в ней токсичного вещества целесообразно пользоваться наиболее чувствительными тест объектами. Такими объектами из животных-гидробионтов являются ветвистоусые раки (дафнии). Они фильтраторы – в короткие сроки пропускают через свое тело объёмы воды, многократно превышающие объемы их собственного тела, вследствие чего в их пищеварительном тракте быстро накапливаются значительные концентрации растворенных и взвешенных токсических веществ. Скорость кумулирования этих веществ у дафнии весьма велика. Например, из среды, содержащей 2,2^| -(4,4^| -дихлордифенил)-1,1,1-трихлорэтан (ДДТ) в нанограммовых количествах, дафнии в течение 4-6 час накапливают его в 10⁵-10⁶ раз больше, чем в окружающей среде (биологическое концентрирование). Аналогичные кумулятивные свойства проявляют дафнии в отношении других инсектицидов. Исследования действия на дафнии более 50-фосфор- и хлорорганических инсектицидов показали, что зависимость летального эффекта от концентрации и от времени воздействия специфичны для каждого инсектицида и позволяет их идентифицировать. Чувствительность этих тестов близка к чувствительности метода ГЖХ. Рачки хорошо размножаются в лабораторных условиях, поэтому их давно используют как стандартные тест объекты и их называют «токсикологической лягушкой». В США тест на выживаемость дафнии в длительном (48 час) опыте принят официально как стандартный показатель токсичности водной среды. Гибель половины тест объектов в продолжительном опыте в пробах воды рассматривается как указание на недопустимый уровень загрязнения.

Оценка токсичности сточных вод путем измерения дегидрогеназной активности ила. Наиболее важной представляется оценка токсичности компонентов сточных вод, основанная на измерении активности жизнедеятельности микроорганизмов активного ила, которые обеспечивают биологическую очистку. Микроорганизмы проявляют специфическую чувствительность к токсичным веществам, присутствующим в воде и могут быть качественными и количественными индикаторами их присутствия.

Из наиболее доступных и наглядных стандартных методов являются методы, основанные на измерении дегидрогеназной активности ила из аэротенков очистных сооружений. Процессы окисления органических веществ протекают в клетках микроорганизмов при активном воздействии ферментов. В активном иле бактерии синтезируют около ста различных ферментов. Каждый фермент селективно воздействует и катализирует обычно только одну из многочисленных стадий превращений, которые претерпевают загрязнители при их окислении.

Одним из важнейших ферментов, катализирующих непосредственно окислительно-восстановительные превращения органических компонентов, являются дегидрогеназы. Дегидрогеназы имеют в своём составе белковую часть - анофермент и кофермент (например, никотинамидадениндифосфат). Они катализируют отщепление водорода от органических веществ.

Общая дегидрогеназная активность ила (ДАИ) характеризует его биохимическую активность. Снижение величины ДАИ свидетельствует о снижении жизнедеятельности микроорганизмов и уменьшение очищаемой способности ила, что в условиях достаточной концентрации усваиваемых форм органических соединений обусловлено наличием токсичных веществ.

Активность дегидрогеназ можно определить с использованием в превращениях молекулы красителя. Так, для тетразолиевых красителей характерно, что окисленные формы их бесцветны, а восстановленные – ярко окрашены.

Таким образом, молекулы указанного соединения могут отщеплять водород органического вещества с помощью дегидрогеназ по следующей схеме:

АН₂ + ТТХ ^{дегидрогеназы} А + ТТХН₂

где ТТХ – окисленная форма красителя, А – окисленный субстрат, ТТХН₂ – восстановленная форма красителя.

Принцип определения ДАИ заключается в измерении количества формазана, который образуется в результате восстановления бесцветной окисленной формы трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), краситель является акцептором водорода, переносимого от окисляемых субстратов ферментами дегидрогеназ и, соответственно, обратно пропорционально величине токсичности объекта. Количество образованного красителя определяют на ФЭК-е.

Величина ДАИ определяется количеством мг формазана, образующегося в литре смеси активного и исследуемых растворов, и находится из выражения ДАИ = а·100 мг/л, где а – количество формазана, определенного из калибровочного графика.

Если ДАИ_опыт ДАИ_{контроль} , то исследуемый раствор не токсичен, и органические и другие компоненты в нём подвергаются биологическому разложению.