Якісні реакції на гормони щитовидної залози

Реакція на гормони щитовидної залози (тироксин)

Принцип методу. Гормони щитовидної залози є йодовмісними сполуками. Внаслідок руйнування утворюється йодистий калій, який окислюється КІО₃ у кислому середовищі з виділенням молекулярного йоду. Під час взаємодії з крохмалем виникає сине забарвлення:

5КІ + КІО₃ + 6НС1  ЗІ₂ + 6КС1 + ЗН₂О;

І₂ + крохмаль  синє забарвлення

Реакції на гормони мозкового шару надниркових залоз (адреналін, норадреналін)

Якісна реакція на адреналін з хлоридом заліза (ІІІ)

Принцип реакції. Внаслідок додавання до розчину адреналіну хлориду заліза (III) рідина забарвлюється в смарагдово-зелений колір за рахунок утворення комплексної сполуки типу феноляту заліза:

Адреналін має слабколужну реакцію й легко окислюється на повітрі з утворенням адренохрому, що супроводжується забарвленням розчину в червоний колір.

Реакції на гормон підшлункової залози (інсулін)

Якісні реакції на інсулін

Принцип реакцій. Інсулін вступає в реакції, специфічні для білків: біуретову, Геллера, Фоля, Міллона. Ці реакції свідчать, що інсулін має білкову природу. Для якісних реакцій використовують розчин інсуліну в ампулах.

Якісне виявлення 17-кетостероїдів у сечі за допомогою н-динітробензолу

Методика визначення

У пробірку поміщають 5 крапель сечі, 5 крапель 30%-го розчину їдкого натру і 5 крапель 2%-го спиртовогo розчину (у етанолі) m-динітробензолу. Перемішують. При стоянні з'являється червоне забарвлення за рахунок утворення продуктів конденсації циклопентанопергідрофенантрену з н-динітробензолом.

Якісна реакція на 11-дезоксикортикостерон

Принцип методу. Під час взаємодії 11-дезоксикортикостерону з сірчаною кислотою з'являється синє забарвлення з червоною флуоресценцією.

Тема: ферменти

Ферменти – біологічні каталізатори білкової природи. Синтезуються клітками організму. Деякі клітки можуть містити до 1000 різних ферментів. За останні 50 років із усіх типів організмів виділено більше 2500 ферментів. Частину з них отримали в кристалічному виді, а для 50 ферментів за допомогою ренгеноструктурного аналізу визначена трьохвимірна просторова структура.

Класифікація ферментів

Міжнародним біохімічним союзом були введені номенклатури: систематична і тривіальна.

Основні риси систематичної номенклатури складаються в наступному:

1. Ферменти за типом реакцій, що вони каталізують, підрозділяються на шість класів, у кожному з яких присутні кілька підкласів (від 4 до 13);

2. Назва ферментів складається з 2 частин: назви субстрату + типу каталізованої реакції + закінчення «аза».

Кожен фермент має шифр, що складається з парних чисел, розділених крапками. Перше число визначає головний клас, друге вказує підклас, третє – підпідклас, четверте – номер ферменту в межах підпідкласу.

Вивчення дії ферментів

Розділ хімії, що вивчає швидкості і механізми хімічних реакцій, називають хімічною кінетикою.

Швидкість хімічної реакції залежить від того, чи знаходяться реагуючі речовини в одній чи різних фазах. Якщо між вихідними речовинами відсутня поверхня поділу, то реакція є гомогенною, а якщо вона присутня, то реакція – гетерогенна.

Швидкість хімічної реакції – це зміна молярної маси реагуючих чи речовин продуктів реакції за одиницю часу в одиниці об'єму (для гомогенних реакцій) чи на одиницю площі (для гетерогенних):

V_{гомогенних} =+

V_{гетероген}. =+

Швидкість хімічної реакції залежить від природи концентрації реагуючих речовин, температури, присутності каталізаторів, площі поверхні торкання реагуючих речовин.

Кількісна характеристика активності ферменту

За одиницю ферментативної активності (Е) приймають кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв.:

E =	мкмоль перетвореного субстрату
	час інкубації в хвилинах

Питому активність ферменту визначають шляхом розподілу числа одиниць ферментативної активності на масу білка (або тканини), г або мг.

Молярну активність ферменту визначають шляхом розподілу числа одиниць ферментативної активності в зразку на масу ферменту, виражену в мікромолях (для очищених ферментів):

Eпитома =	Е
	маса білку (тканини), г чи мг

Eмолярна =	Е
	маса ферменту, мкмоль

Кількісна характеристика активності ферментів у біологічних рідинах

Активність ферментів крові: α-амілаза – г/ (ч·л) АсАТ, АлАТ, ЛДГ, ХЭ, КФ, лужної фосфатази – у ммоль/(год·л).

трипсину – мкмоль (мл/год.)

Властивості ферментів

Вплив концентрації і природи реагуючих речовин на швидкість реакції

При взаємодії речовин помічені наступні закономірності:

1. Органічні речовини з ковалентними зв'язками реагують повільніше, ніж речовини з іонними і полярними ковалентними зв'язками;

2. Гомогенні реакції протікають швидше, ніж гетерогенні.

Кількісно зв'язок між швидкістю реакції і концентраціями реагуючих речовин визначається законом діючих мас, установленим норвезькими вченими К. М. Гульдбергом і П. Вааге: при постійній температурі швидкість хімічної реакції прямо пропорційна діючим масам – молярним концентраціям реагуючих речовин, узятим у ступені відповідних стехіометричних коефіцієнтів.

У загальному вигляді для реакції, що протікає по рівнянню:

aA+ bB = cC + dD;

де А і В – вихідні речовини; С і D – продукти реакції; а, b, c, d – коефіцієнти в рівнянні реакції. Швидкість реакції визначають по формулі:

V = k × [А]^a × [У]^b;

де k – константа прямої реакції, що чисельно дорівнює швидкості реакції, якщо концентрація кожного з реагуючих речовин дорівнює 1 моль/л.

Молекулярність реакції – число молекул, одночасно взаємодіючих і які здійснюють елементарний акт хімічного перетворення. Вона може характеризуватися тільки цілими числами. Якщо в елементарному акті реакції бере участь одна молекула, що перетворюється в одну чи декілька молекул інших речовин, то така реакція називається одномолекулярною чи мономолекулярною.

Якщо в реакції одночасно беруть участь дві молекули, то реакція – бімолекулярна:

сахароза + НОН = -глюкоза + -фруктоза.

Реакції, елементарний акт яких зводиться до одночасного зіткнення трьох молекул, називаються тримолекулярними. Статистично цей акт малоймовірний, і чисті приклади тримолекулярних реакцій зустрічаються рідко. Реакції з молекулярністю більше трьох у хімічній практиці невідомі.

У хімічній кінетиці користуються поняттям: порядок реакції, що визначається кінетичним рівнянням, що виражає залежність швидкості реакції від концентрації реагуючих речовин і дорівнює сумі їх показників ступенів у даному рівнянні. Наприклад: глюкозо-6-фосфат + вода = глюкоза + фосфорна кислота; швидкість реакції визначається виразом v = k [глюкозо-6-фосфат]; (концентрація води постійна, тому враховується в константі і не записується у виразі). Дана реакція є реакцією першого порядку. Швидкість реакції першого порядку прямо пропорційна і концентрації однієї з реагуючих речовин.

Якщо у виразі для швидкості реакції відсутні концентрації речовин і швидкість реакції дорівнює тільки константі v = k, то такі реакції мають нульовий порядок. Графічно залежність швидкості таких реакцій від концентрації виражається прямою лінією, рівнобіжною з віссю абсцис.

Ферментами або ензимами називають біологічні каталізатори, які є продуктами життєдіяльності живих організмів.

Так як і у технічних каталізаторів, у ферментів в гетерогенному каталізі бере участь не вся молекула, а лише окремі ділянки, які називаються активними центрами. Ферменти поділяються на дві групи: прості ферменти-білки і складні ферменти-білки. Перші є ферментами тільки білкової природи, а другі складаються з білка (апофермент) і небілкового компонента, яким можуть бути вітаміни, їх ефіри ортофосфатної кислоти, нуклеотиди, геми, йони металів. Небілкові компоненти складних ферментів називають простетичними групами, кофакторами, коферментами.

Взаємодія між активними центрами ферментів і молекулами субстрату визначається силами хімічних, ковалентних, електростатичних зв’язків і до певної міри водневими зв’язками та вандерваальсовими силами.

У складних ферментів функцію активних центрів виконують переважно простетичні групи із залученням білкових компонентів на окремих ділянках молекул білка. У простих ферментів активні центри утворюються за рахунок своєрідного розташування амінокислотних залишків у структурі білка. До таких амінокислотних залишків належать – SH-групи цистеїну; ОН-групи серину; NH-група імідазолу в гістидині, а також карбоксильні групи аспарагінової і глутамінової амінокислот, індольна група триптофану та ін.

Суттєвим моментом, що визначає швидкість ферментативної реакції, є концентрація реагуючих речовин, враховуючи тим більше те, що фермент попередньо утворює проміжну сполуку з субстратом. При вивченні кінетики ферментативних процесів проводять вимірювання початкових швидкостей реакцій, що досягається шляхом зміни концентрації субстрату при незмінності всіх інших умов. Міхаеліс і Ментен розробили теорію, яка пояснює залежність початкової швидкості від концентрації субстрату. Вони виходили із такого рівняння:

F+S FS P+F,

де: F – фермент (ензим); S – субстрат; FS – фермент-субстратний комплекс; P – продукт реакції; k – константи реакцій.

За умови, що [S]>>[F]_o, i [S]_o>>[FS] та [S]_о ≈ [S] ([F]_o і [S]_o – початкові концентрації ферменту і субстрату, початкову швидкість ν_o утворення продукту можна описати рівнянням:

(13)

Концентрація ферменту і субстрату в момент часу τ від початку реакції:

[F] = [F]₀–[FS], (14)

[S] = [S]₀–[FS] (15)

Міхаеліс і Ментен припустили, що k_–1>>k₂. Тому першу стадію утворення комплексу [ES] можна розглядати як процес швидкого встановлення динамічної рівноваги. Константа рівноваги:

(16)

Якщо в рівняння (16) підставити значення [F] згідно з (14), то:

, (17)

звідси:

(18)

На підставі (13) і (18) можна визначити υ₀. Виходячи з умови, що [S]₀>>[F]₀, витратою субстрату при вивченні початкової швидкості можна знехтувати, тобто [S]₀ ≈ [S], тому:

(19)

Часто величина k₂ наближається до k_–1 або навіть перевищує її. Тому був запропонований інший підхід, незалежний від відносних величин k_–1 і k₂, за умови перебігу реакції у стаціонарному режимі, тобто якщо

Це дає можливість записати кінетичне рівняння реакції:

, а згідно з (14):

k₁([F]_o–[FS])[S]–(k_–1+k₂)[FS] = 0 (20)

Тоді відносно [FS], одержимо:

(21)

Відповідно рівнянь (13) і (21) вираз для початкової стаціонарної швидкості буде таким:

, (22)

де K_m – константа Міхаеліса-Ментена яка дорівнює:

(23)

Рівняння (22) є рівнянням Міхаеліса-Ментена. Рівняння (19) є окремим випадком рівняння Міхаеліса-Ментена, коли k_–1>>k₂, тому:

Добуток k₂·[F]_o має розмірність швидкості реакції, що звичайно називають швидкістю ферментативної реакції і позначають υ_m (υ_m – швидкість, з якою відбувається реакція, якщо фермент перебуває у складі комплексу FS). Тобто, при

[F]_o = [FS], або υ_m = k₂[F]₀ (24)

Тоді рівняння (22) можна записати так:

(25)

Отже, стаціонарна швидкість ферментативної реакції при [S]₀>>[F]₀ має гіперболічну залежність від концентрації субстрату і лінійну – від початкової концентрації ферменту (рис. 21 а, б).

а) б)

Рис. 21. Залежність початкової швид-кості υ₀ ферментативної реакції від концентрацій субстрату (а) і ферменту (б).

Ці залежності дійсно характеризують кінетику більшості ферментативних реакцій, а рівняння Міхаеліса-Ментена формально описує початкову стаціонарну швидкість.

Рівняння (25) має два граничних випадки. При низькій концентрації субстрату К_m>>[S] швидкість описується рівнянням першого порядку відносно [S]: . При високій концентрації субстрату [S]>>К_m швидкість має нульовий порядок відносно [S]: υ₀ ≈ υ_m. Ці два випадки стосуються як початкової фази, так і наступних періодів реакції (рис. 21, а).

Обчислення К_m спрощується, якщо використати замість рівняння (25) його зворотні показники, згідно з Лайнуівером-Берком і за допомогою графіка (рис. 22) можна визначити К_m, оскільки при рівняння (24) дає:

, або K_m=[S]

Рис. 22. Графічне визначення υ_m і К_m заЛайнуівером-Берком.

Таким чином, константа Міхаеліса К_m чисельно дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість ферментативної реакції досягає половини максимальної υ_m.

Визначення ферментативної активності використовується з діагностичною метою. Наприклад, інфаркт міокарда супроводжується різким підвищенням активності ферменту аспартатамінотрансферази (АсАТ) ще до появи електрокардіографічних змін у міокарді. Тому метод діагностики за активністю АсАТ точніший і дає відомості раніше.

Термолабільність ферментів

Зі збільшенням температури біохімічної реакції росте число зіткнень молекул, що приводить до збільшення швидкості реакції. Голландський вчений Я. Г. Вант-Гофф на підставі численних спостережень встановив, що при підвищенні температури на 10^о С швидкість гомогенної реакції збільшується в 2 – 4 рази. Число, що показує, у скільки разів збільшується швидкість реакції при збільшенні температури на 10^о С, називається температурним коефіцієнтом (у).