Глава 3. Генетическая информация, ее наследственность и изменчивость.

3. 1. Нуклеиновые кислоты – материальный носитель наследственной информации (молекулярные основы жизни).

К аким же образом клетка, сохраняя свою целостность, многократно делясь, строит фенотип, согласно программы, которую называют генетическая программа? При этом степень проявления различных признаков (изменчивость) сильно зависит от внешних условий, в которых создается этот фенотип. Возникает одновременно вопрос. На каком языке записана эта генетическая программа, т.е. генетическом коде и кто в клетке умеет его читать? Возникает и множество других вопросов, связанных с самовоспроизводством и самоорганизацией клетки в процессе создания живого организма и бесконечном ряду его поколений.

Сегодня мы уже хорошо знаем, что наследственность и изменчивость обеспечиваются функционированием особого материального субстрата - нуклеиновыми кислотами в основе которых лежат сахара рибоза и дезоксирибоза (рис. 15). И каким требованиям должен отвечать этот субстрат?

Во-первых, он должен обладать способностью к самовоспроизведению – без этого передача наследственной информации невозможна.

В

Рисунок 15. Пентозы, входящие в состав нуклеиновых кислот

о-вторых, для поддержания устойчивости основных характеристик в ряду поколений он должен сохранять постоянными свою структуру и функции.

В-третьих, для обеспечения условий длительного развития живой материи в меняющихся условиях наследственный материал должен обладать способностью приобретать изменения и воспроизводить их.

Отсюда следует, что для осуществления жизни необходимо вычленение специального пространства, в котором эти процессы могли бы целенаправленно осуществляться. И таким ограниченным пространством для жизни является клетка (фенотип). В ней сосредоточились все необходимые структуры (хромосомы, рибосомы, митохондрии, хлоропласты и др.), которые в тесной взаимосвязи осуществляют все жизненные функции. Эту сущность эволюции жизни хорошо отражает как раз первая часть формулировки новой аксиомы биологии – "клетка является элементарной единицей фенотипа живого, хранителем и координатором её генетической программы…".

Исследования, проведенные несколькими поколениями ученых, показали, что только нуклеиновые кислоты отвечают перечисленным требованиям и, таким образом, являются материальным носителем наследственной информации, или ее субстратом.

Нуклеиновые кислоты были открыты в 1870 г. Фридрихом Мишером. Свое название они получили из-за кислотных свойств и места идентификации – ядра клетки. Их делят на две большие группы – дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК). ДНК содержится в хромосомах ядра, а также в значительно меньшем количестве в митохондриях и хлоропластах. РНК содержится в ядре (особенно много ее в ядрышке), а также в рибосомах и в меньших количествах в других органоидах.

Нуклеиновые кислоты – это полимер, мономерами которых являются нуклеотиды. Молекула РНК содержит от 100 до 100 тыс. нуклеотидов, ДНК – от нескольких тысяч до многих миллионов.

Каждый нуклеотид состоит из трех химически разнородных частей, соединенных ковалентными связями: моносахарида пентозы; азотистого основания, соединенного с первым атомом углерода сахара; остатка фосфорной кислоты.

Пентоза в ДНК представлена дезоксирибозой, а в РНК – рибозой (рисунок 15). Входящие в нуклеиновые кислоты азотистые основания делятся на два типа – пурины и пиримидины. К пуриновым основаниям относятся аденин, гуанин, пиримидиновым – тимин и цитозин (рисунок 16). В РНК вместо тимина содержится урацил.

Рисунок 17. Участок полиадениловой кислоты

• Рисунок 16. Азотистые основания, входящие в состав молекул ДНК и РНК

Нуклеотиды соединены в линейные цепи посредством фосфоэфирных связей между 5-ым атомом углерода одного сахара и 3-им атомом углерода другого. Специфичность нуклеиновых кислот определяется последовательностью расположения нуклеотидов.

Существенное отличие ДНК и РНК в том, что РНК состоит из одной цепочки нуклеотидов, а ДНК – из двух. Последовательное чередование в местах образования диэфирных связей 3-го и 5-го атомов углерода позволяет выделить у полинуклеотидной цепи 3’- и 5’-концы (рисунок 17). Причем напротив 3’-конца одной цепи находится 5’-конец другой. Указанная закономерность именуется принципом антипараллельности полинуклеотидных цепей нуклеиновых кислот.

Исследования Эдвина Чаргаффа показали, что в молекулах ДНК молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина, а гуанина – содержанию цитозина. Таким образом, позже рентгеноструктурные исследования Мориса Уилкинсона и Розалинд Фрэнклин позволили обнаружить спиральную структуру молекул ДНК и где количество пуринов равно количеству пиримидинов. Эта закономерность была названа правилом Ч аргаффа. Кислотно-щелочное титрование показало наличие водородных связей, стабилизирующих структуру молекулы.

В

Рисунок 18. Модель ДНК Дж. Уотсона и Ф. Крика

1953 г. американский биохимик Джеймс Уотсон и английский физик Френсис Крик на основании сопоставления данных рентгеноструктурного и биохимического анализа предложили модель макромолекулы ДНК. По этой модели длинные полинуклеотидные цепи, из которых состоит ДНК, взаимно закручены вокруг общей оси. Каждая нуклеотидная пара повернута к соседней паре под углом 36°, в результате 10 последовательных пар образуют один полный виток спирали. Такой виток имеет длину 3.4А (ангстрем - внесистемная единица длины, равная 10^-10м), т.е. по 3.4А на одну пару нуклеотидов. Радиус двойной спирали составляет 10А.

Пуриновые и пиримидиновые основания одной цепочки имеют водородные связи с пиримидиновыми и пуриновыми основаниями другой (рисунок 19). Связи жестко подчиняются принципу комплементарности, заключающемуся в том, что с тимином одной цепи взаимодействует аденин другой, а с гуанином одной – цитозин другой цепи.

С

Рисунок 19. Двойные и тройные водородные связи, соединяющие полинуклеотидные цепи ДНК

помощью модели ДНК (рисунок 18) удалось объяснить многие свойства нуклеиновых кислот. В настоящее время она общепризнанна. В частности, была объяснена репликация ДНК – основа передачи наследственной информации, закономерности мутаций – главного механизма изменчивости. Экспериментально схема репликации была подтверждена американским генетиком Артуром Корнбергом в 1958 г.

Репликация. Самокоррекция и репарация ДНК.

В живой клетке самоудвоение молекулы ДНК – репликация – протекает в синтетический период интерфазы. Начинается оно с раскручивания участка двойной спирали под действием фермента ДНК-топоизомеразы. Затем происходит разрыв водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями двух цепей нуклеотидов. Благодаря этому участок двойной цепи ДНК разделяется на два одинарных. Далее каждое основание взаимодействует с комплементарным свободным трифосфатом дезоксинуклеозида, имеющимся в кариолимфе в готовом для полимеризации виде. Оставаясь фиксированными на исходной матричной цепи, дезоксинуклеозидтрифосфаты вступают во взаимодействие между собой путем образования эфирных связей между соседними фосфатными группами. В результате вместо одной молекулы ДНК появляется две новых, являющихся полными копиями исходной. Процесс репликации контролируют несколько ферментов, называемых ДНК-полимеразами. Сборка молекулы ДНК возможна только в одном направлении – от 5’- к 3’-концу. На одной из цепей-матриц сборка дочерней ДНК происходит непрерывно, и именно в вышеуказанном направлении. На другой, антрипараллельной матрице синтез идет путем разрезания исходной двойной цепи на отрезки по 50...150 нуклеотидов при участии фермента рестриктазы, наращивания удвоенных фрагментов в направлении от 3’- к 5’-концу, а затем их сшивание отрезков двойной цепи по завершению репликации в присутствии фермента лигазы. В пределах самого реплицирующегося фрагмента присоединение новых нуклеотидов происходит в "правильном направлении", т.е. от от 5’- к 3’-концу.

Синтез двойной цепи начинается только при наличии затравки (праймера) – короткой последовательности РНК, образуемой с участием фермента РНК-праймазы. После завершения удвоения фрагментов ДНК лигаза не только их сшивает, но и удаляет более ненужный праймер. Рассмотренный механизм репликации называется полуконсервативным.

Наряду с устойчивостью ДНК к внешним воздействиям надежность передачи генетической программы обеспечивается точностью воспроизведения структуры этой молекулы при репликации и механизмами устранения, иногда возникающих информационных сбоев.

Устойчивость ДНК к внешним воздействиям достигается благодаря довольно низкой реакционной способностью этой молекулы.

Главная роль в высокой точности воспроизведения структуры в процессе репликации принадлежит ДНК-полимеразе. Именно этот фермент отбирает нужные нуклеозидтрифосфаты и присоединяет их к растущей дочерней цепи ДНК. Доля ошибочно включенных нуклеотидов не превышает 1*10^-5 пар азотистых оснований. Ошибка, допущенная ДНК-полимеразой, может быть исправлена благодаря механизму самокоррекции: еще до завершения репликации "неправильно" включенный нуклеотид отщепляется от растущей последовательности и заменяется "правильным", комплементарным нуклеотиду матричной цепи. Механизм самокоррекции снижает долю ошибочных включений нуклеотидов на порядок (т.е. до 1*10^-6 пар).

Все же часть ошибок, допущенных в процессе репликации, сохраняются в дочерней ДНК; к ним добавляются изменения "готовых" молекул, обусловленные апуринизацией аденина и гуанина и дезаминированием цитозина. Большинство указанных информационных сбоев устраняются действием механизма репарации. Механизм репарации основан на удалении искаженных последовательностей нуклеотидов и замене их "правильными", синтезированными на второй комплементарной цепи ДНК (эксцизионная репарация), либо на обмене фрагментами между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК (пострепликативная репарация). Имеются и иные схемы репарации.

Благодаря механизмам репарации частота ошибок в молекуле ДНК снижается еще на три порядка (до 1*10^-9 пар нуклеотидов).

Однако, если количество повреждений структуры ДНК остается высоким, то процесс репликации на ДНК блокируется. Деление клетки, содержащей такую ДНК, прекращается.

Транскрипция. Процессинг мРНК.

ДНК химически довольно инертна, а потому непосредственно в синтезе белка не участвует. Почти вся ДНК сосредоточена в ядре, тогда как синтез белков происходит в цитоплазме. Вот почему в процессе передачи информации участвует промежуточное звено – рибонуклеиновые кислоты (РНК). Перенос информации с двухцепочечной молекулы ДНК на одноцепочечные молекулы РНК называется транскрипцией.

Выделяют три стадии транскрипции: инициацию, элонгацию и терминацию. Главную роль в транскрипции играет фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, который часто именуют просто РНК-полимеразой.

Инициация включает обнаружение РНК-полимеразой особого участка молекулы ДНК, указывающего место начала транскрипции – промотора. Среди нуклеотидных последовательностей промотора часто встречаются повторно чередующиеся пары аденина и тимина, называемые последовательностями Прибнова. После присоединения к промотору РНК-полимераза раскручивает соответствующий участок спирали ДНК. На одной из освободившихся цепочек ДНК и происходит синтез РНК. В качестве матрицы может служить лишь та из дезоксирибонуклеиновых цепочек, которая обращена к ферменту своим 3’-концом. Ее именуют кодогенной.

Элонгация – это дальнейшее наращивание цепочки РНК. Она происходит путем присоединения к растущей цепочке РНК соответствующих комплементарных нуклеотидов с продвижением от 5’- к 3’-концу.

Таким образом, транскрипция, как и репликация, осуществляется с соблюдением принципов комплементарности и антипараллельности.

Завершение транскрипции (терминация) происходит после того, как РНК-полимераза встретит на кодогенной цепочке РНК специфическую последовательность нуклеотидов – терминатор.

После терминации РНК-полимераза освобождается и от ДНК, и от вновь синтезированной молекулы РНК. Одноцепочечные участки ДНК вновь объединяются в двухспиральную структуру. Транскрипция завершена.

Процесс транскрипции в про- и эукариотической клетке имеет некоторые существенные отличия. Если у прокариот синтез всех трех видов РНК осуществляется одной РНК-полимеразой, то транскрипционный комплекс эукариот представлен группой ферментов. РНК-полимераза I локализована в ядрышках; она "обслуживает" синтез рРНК. РНК-полимераза II находится в кариоплазме и катализирует синтез мРНК. РНК-полимераза III участвует в транскрипции тРНК и небольших мРНК. В митохондриях и пластидах имеется свой тип РНК-полимеразы.

Второе важное отличие обусловлено неодинаковой организацией генов про- и эукариот. У первых основная часть нуклеотидных последовательностей представляет собой кодирующие области; исключением являются участки промотора и терминатора. Эукариотам характерна экзон-интронная структура гена. Экзоны – это кодирующие участки генов, содержащие информацию о последовательности аминокислот. Интроны - это неинформативные нуклеотидные последовательности, не участвующие в кодировании информации. Первичные транскрипты, синтезируемые РНК-полимеразой и включающие комплементарные копии всей экзон-интронной структуры, представляют собой не мРНК, а своего рода заготовку. Такая "заготовка", именуемая гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), прежде чем переместиться из ядра в цитоплазму и включиться в процесс трансляции должна пройти созревание, или процессинг.

Процессинг включает удаление интронов и соединение (сплайсинг) экзонов, кэпирование и полиаденилирование.

У многих эукариот (млекопитающие, некоторые растения, дрожжи) доля интронов, подлежащих удалению, составляет до 80% всей гяРНК. Установлено, что вырезание разных интронов из одной и той же молекулы гяРНК может привести к образованию неодинаковых мРНК.

Кэпирование - это присоединение к 5’-концу метилгуанозин-3-фосфата. Назначение кэпа состоит в обеспечении распознания мРНК рибосомами в цитоплазме.

Полиаденилирование представляет собой присоединение к 3’-концу мРНК нескольких сот остатков адениловой кислоты.

После завершения процессинга мРНК готова к перемещению в цитоплазму и участию в транскрипции.

Трансляция.

Синтез полипептидной цепочки белка на мРНК обозначают термином трансляция. Местом, где происходит трансляция, являются рибосомы. Структура рибосом образуется довольно крупными молекулами РНК, именуемыми рибосомными, а также специфическими белками. В малой субъединице эукариотической рибосомы содержится одна молекула рРНК, в большой – три молекулы. В процессе синтеза белка рРНК выполняет две функции: связывает рибосомы с определенной нуклеотидной последовательностью мРНК, что необходимо для правильного считывания информации при образовании полипептидной цепи; обеспечивает контакт рибосомы и тРНК. Рибосомы имеют две бороздки, в одной из которых располагается строящаяся полипептидная цепь, в другой – мРНК, а также два участка – А-участок, занимаемый тРНК с присоединенной к ней активированной аминокислотой и П-участок, на котором находится тРНК с растущей полипептидной цепью.

Доставку аминокислот к рибосомам выполняют транспортные РНК (тРНК). По-видимому, число видов тРНК соответствует числу стандартных аминокислот, т. е. 20-ти. тРНК – это небольшая молекула с молекулярной массой 26 000 дальтонов и скоростью седиментации 4S, состоящая примерно из 70...80 нуклеотидов. Она отличается характерной конфигурацией, напоминающей лист клевера. Цепочка тРНК имеет взаимно комплементарные участки, образующие выступы. Места молекулы, где цепь изгибается на 1800, называют головками. На головках размещаются триплеты оснований. Структура одного из них специфична для данной тРНК. Он именуется антикодоном. Антикодон данной тРНК комплементарен кодону соответствующей мРНК. Один из концов молекулы тРНК – акцепторный. К нему через ковалентную связь присоединяется "своя" аминокислота.

В процессе биосинтеза каждая аминокислота проходит три стадии.

На первой стадии происходит активация аминокислоты путем ее взаимодействия с АТФ; при этом образуются аминоациладенилаты. Процесс катализируется ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами.

На второй стадии осуществляется аминоацилирование тРНК, т.е. присоединение соответствующего аминоациладенилата к определенной тРНК и образование комплекса аминоацил-тРНК.

На третьей стадии происходит полимеризация аминокислот и образование полипептидной цепи. Третья стадия – это и есть собственно трансляция.

В ходе трансляции молекула мРНК 5’-концом присоединяется к малой субъединице рибосомы. В большую субъединицу входят две молекулы тРНК, соединенные с аминокислотами. Вход в рибосому "разрешен" только таким тРНК, атикодоны которых комплементарны кодонам участка мРНК, находящегося в рибосоме в данный момент. Затем молекула мРНК движется через рибосому в направлении от 5’- к 3’-концу. Молекула тРНК сначала присоединяется к А- участку рибосомы, потом переходит на ее П-участок. После присоединения аминокислоты, доставленной этой тРНК к растущей полипептидной цепи, молекула тРНК покидает рибосому. На длинной цепочке мРНК могут находиться несколько рибосом одновременно, образуя полирибосому. В каждой из рибосом протекает синтез одного и того же типа молекул белка, но только в разных его стадиях.

Выделяется три фазы трансляции.

Основное событие фазы инициации – объединение в единый комплекс двух рибосомных субъединиц (большой и малой), мРНК и аминокислоты формилметионина. тРНК, доставившая в рибосому формилметионин, комплементарно соединяется со стартовой последовательностью нуклеотидов мРНК – АУГ. В конце первой фазы транскрипции стартовый кодон мРНК перемещается на П-участке субъединицы; А-участок занимает следующий кодон.

Фаза элонгации начинается с присоединения к формилметионину второй аминокислоты. Затем ко второй аминокислоте присоединяется третья, и т.д. В дальнейшем фермент аминопептидаза вырезает метионин из аминокислотной последовательности; если белок начинается с метионина, то удалению подлежит только формильная группа.

Фаза терминации заключается в прекращении синтеза полипептида. Сигналом к этому служит поступление на А-участок одного из трех нонсенс-кодонов мРНК – УАГ, УАА или УГА. Нонсенс-триплетам не соответствует ни один из атикодонов тРНК. Поэтому доставка аминокислот транспортными РНК в рибосому прекращается. Терминация синтеза завершается освобождением полипептида и распадом рибосомы на субъединицы.