Практическое задание

Для исследования нервной ткани чаще всего используются методы выявления хроматофильной субстанции, импрегнация сере­бром и суправитальное окрашивание метиленовым синим. Для фик­сации нервной ткани обычно применяют 4% (разведение 1:10) нейт­ральный формальдегид.

Окрашивание хроматофильной субстанции по методу Ниссля в модификации Майера

Приготовление раствора: 2,0г тионина и 1,0 г борной кислоты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, затем при­бавляют несколько кристаллов тимола. Перед употреблением рас­твор фильтруют.

Методика окрашивания: 1) расправленные парафи­новые срезы без наклейки на предметное стекло и без депарафини-рования переносят в раствор тионина на 24 ч, при этом срезы должны плавать на поверхности красителя; 2) срезы вылавливают на предметное стекло, затем высушивают в термостате при 37° С. Депарафинируют срезы и заключают в канадский бальзам.

Результат: ядрышко и хроматофильная субстанция цито­плазмы сине-фиолетового цвета.

Импрегнация нейрофибрилл серебром по Бильшовскому - Грос в модификации Лаврентьева

Этим методом выявляются клетки нервных ганглиев, нервные волокна и нервные окончания.

Приготовление растворов. 1. 20% раствор нитрата cеребра готовят из кристаллического серебра на бидистиллированной (дважды дистиллированной) воде. Раствор может быть приго­товлен заранее и храниться в темном месте. Потемневший раствор не годен к употреблению.

2. Аммиачное серебро готовят перед употреблением. Для этого в чашечку (часовое стекло) наливают 5 мл 20% раствора нитрата серебра, добавляют по каплям 25% раствор аммиака при постоян­ном помешивании. Раствор аммиака добавляют до тех пор, пока образовавшийся вначале осадок не растворится.

3. Аммиачная вода готовится путем добавления 1 части аммиака к 2 частям дистиллированной воды.

4. 20% раствор кислого формалина готовят на водопроводной воде.

5. Раствор хлорида золота получают, добавляя 1-2 капли 1% раствора хлорного золота к 1 мл дистиллированной воды.

Методика импрегнации: 1) из фиксированного в нейт­ральном формалине материала приготавливают в криостате замо­роженные срезы толщиной 12-15 мкм и помещают в дистиллированную воду; 2) срезы стеклянной палочкой с загнутым концом (ме­таллические использовать нельзя) переносят из дистиллированной поды в 20% раствор нитрата серебра на 2-30 мин и более (время устанавливают для каждого данного объекта опытным путем); 3) проводят срезы через 3-4 порции 20% раствора кислого формалина до исчезновения помутнения; 4) прикоснувшись срезом (не снимая его со стеклянной палочки) к фильтровальной бумаге, удаляют лишнюю жидкость и переносят срезы в раствор аммиачного сере­бра. Пользуясь малым увеличением микроскопа, непосредственно па часовом стекле наблюдают, как в срезах, погруженных в аммиач­ное серебро, выявляются нервные элементы; 5) переносят срезы в аммиачную воду на 10-15 мин; 6) промывают срезы в нескольких порциях дистиллированной воды до исчезновения запаха аммиака (до нескольких часов); 7) далее следуют обезвоживание в спиртах, помещение в ксилол, заключение в бальзам. Нервные элементы при этом имеют темно-коричневый или черный цвет, окружающие ткани - желтый или золотисто-коричневый. При необходимости убрать фон срезы после промывки в дистиллированной воде поме­щают в раствор хлорного золота до тех пор, пока они не приобретут серый цвет. Затем их переносят в 5% раствор гипосульфита и про­мывают в нескольких порциях дистиллированной воды. Нейрофибриллы в результате становятся черными, а фон – прозрачным.

При импрегнации серебром лабораторная посуда должна быть абсолютно чистой. Если фон импрегнируется слишком сильно, необходимо добавить 1-2 капли аммиака в аммиачное серебро, а в том случае, если срезы в аммиачном серебре быстро темнеют, сле­дует уменьшить продолжительность обработки срезов 20% форма­лином.

Суправитальное окрашивание метиленовым синим. Этот метод применяется для окрашивания нервных волокон и нервных оконча­ний, а также нервных ганглиев.

Приготовление растворов. 1. Раствор Рингера-Локка. Для тканей млекопитающих используют раствор следу­ющего состава: хлорид натрия (NaCl) – 6 г, хлорид калия (КСl) – 0,25 г, хлорид кальция (СаС1₂) – 0,25 г, бикарбонат натрия (Na₂C0₃) – 0,25 г, глюкоза – 1,0 г, дистиллированная вода – до 1000 мл.

2. 1% раствор метиленового синего. 1 г химически чистого мети-ленового синего растворяют в 100 мл раствора Рингера-Локка. Раствор может храниться.

3. Фиксирующий раствор молибдата аммония. Непосредственно перед употреблением 5-7 г молибдата аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор фильтруют.

Методика окрашивания.

Введение раствора может осуществляться различными способами:

1) инъекцией в кровяное русло;

2) введением раствора в полость тела (в плевральную или брюшную);

3) инъекцией красящего раствора в соединительную ткань исследуемого органа;

4) помещением кусочка ткани непо­средственно в раствор красителя. В зависимости от исследуемого объекта 1% раствор метиленового синего перед употреблением раз­водят в 2, 4, 6, 8 или 16 раз. Оптимальную концентрацию красителя для данного объекта следует найти эмпирически (на основе соб­ственного опыта).

При проведении окрашивания путем инъекции красителя в кро­вяное русло предварительно раствором Рингера-Локка тщательно вымывают из сосудов кровь. Для этого подогретый до 37° С раствор вводят через канюлю либо в аорту (у мелких животных), либо непо­средственно в артерию органа. 0,25-0,125% раствор метиленового синего, подогретый до 37° С, вводят в сосуд вплоть до появления в поверхностных частях органа микроскопически выявляемой окраски нервных элементов. Обычно инъекция продолжается 30- 40 мин. Затем, если объект плотный, маленькие кусочки органа помещают для докраски в чашку Петри, на дне которой находится фильтровальная бумага, смоченная 0,125% раствором метиленового синего, и наносят на поверхность объекта по каплям раствор красителя. Ход окрашивания контролируют при малом увеличении микроскопа, зажав небольшой кусочек органа между двумя пред­метными стеклами.

Окрашивание погружением объекта в краситель производится так же, как докрашивание, описанное выше. Метод погружения в краситель используют для окрашивания тонких объектов, например стенок полых органов.

Фиксация объекта производится немедленно после окрашивания м растворе молибдата аммония, охлажденного до 1-3° С. Фиксация проводится в холодильнике в течение 2-5 ч. Затем следует про­мывка в дистиллированной воде в течение 1-2 ч, причем воду сме­няют несколько раз.

Перед заключением в бальзам пленочные препараты проводят через 96% и 100% спирты и ксилол. При необходимости приготовить срезы материал после окрашивания заливают в целлоидин.

Как пленочные препараты, так и срезы можно докрасить каким-либо ядерным красителем, например квасцовым кармином.