Практическое задание

Приготовление пленочных препаратов рыхлой волокнистой сое­динительной ткани и окрашивание их железным гематоксилином по методу Ясвоина.

Приготовление растворов: 1. Раствор гематоксили­на: 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, приливают 90 мл дистиллированной воды и оставляют до созревания (раствор должен приобрести красный цвет). 2. 6% раствор железоаммиачных квасцов. Непосредственно перед употреблением растворы смешивают на часовом стекле в таком отношении, чтобы осадок выпал не раньше чем через 0,5 мин, т. е. через срок, достаточный для окрашивания препарата. Если осадок выпадает через более длительный срок, препарат будет окрашен недостаточно контрастно. В среднем к 5 каплям квасцов прибавляют, встряхивая, 10-12 капель гематоксилина (добавляют гематоксилин в квасцы, а не наоборот).

Изготовление пленочных препаратов. Кожу вместе с подкожной соединительной тканью фиксируют в 10% нейт­ральном формалине (см. главу 21). Дальнейшую обработку можно проводить через несколько часов, а можно и отложить на 10-15 дней (не более, так как, если материал перестанет быть бархати­стым, а станет жестковатым, он уже не годится для дальнейшей обработки). Из находящейся на поверхности стекловидно-прозрач­ной соединительной ткани острыми ножницами вырезают узкую полоску, помещают ее на предметное стекло, смазанное белком с глицерином (см. главу 21) и приступают к ее растягиванию двумя препаровальными иглами. Полоске надо дать слегка подсохнуть. Если она будет слишком влажной, она будет не растягиваться, а перемещаться по стеклу из стороны в сторону, если слишком высох­нет, вообще не будет растягиваться. В результате растягивания должна получиться тонкая пленка. Не давая пленке окончательно высохнуть, ее помещают на 5 мин в 96% спирт. Затем предметное стекло с прилипшей к нему пленкой помещают в 70% спирт и, нако­нец, в дистиллированную воду на 5-10 мин.

Методика окрашивания. Приготовленный краситель на несколько секунд наливают на препарат. Когда выпадает осадок, препарат поливают большим количеством водопроводной воды, промывание продолжают в течение 15-30 мин. Сливать краситель с препарата нельзя, иначе осадок плотно пристанет к ткани.

Окрашивание эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта

Приготовление растворов: 1. Раствор резорцин-фуксина (фуксилина). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г основного фуксина и 4 г резорцина, доводя до кипения, и прибав­ляют 25 мл официнального раствора полуторахлористого железа (официнальный раствор полуторахлористого железа представляет собой 50% раствор водного хлорного железа - FeCl₃-6H₂0). Рас­твор кипятят в течение 5 мин, все время, помешивая, охлаждают и фильтруют. Фильтрат выливают, а фильтр с образовавшимся на нем осадком после высыхания снимают с воронки, кладут в чашку, в которой кипятили смесь, заливают 200 мл 96% спирта и осторожно в водяной или песочной бане доводят до кипения. С фильтра остатки краски соскабливают в спирт, а фильтр выбрасывают. Спиртовой раствор краски охлаждают, фильтруют, доливают до 200 мл 96% спиртом и прибавляют 4 мл концентрированной хлористоводород­ной кислоты (плотность 1,16 - 1,19). Раствор хранится 1,5-2 мес.

2. Раствор литиевого кармина Орта. К 100 мл насыщенного рас­твора карбоната лития (при 20°С это 1,52% раствор) добавляют 2,5 г кармина, кипятят 5-10 мин, охлаждают и фильтруют.

Методика окрашивания: 1) срезы (замороженные, целлоидиновые или депарафинированные парафиновые) окрашивают в литиевом кармине 10-15 мин; 2) не ополаскивая срезов, переносят их в 1% раствор хлористоводородной кислоты на 70% спирте на 5-10 мин и более. Этот раствор фиксирует кармин в ядрах и одновременно дифференцирует, извлекая его из других структур; 3) промывают срезы в водопроводной воде и 70% спирте;

4) переносят в резорцин-фуксин на 20-30 мин; 5) ополаскивают в дистиллированной воде 1-2 мин; 6) дифференцируют в 1% спиртовом растворе хлористоводородной кислоты (или в чистом 96%) под контролем микроскопа до тех пор, пока не выступит отчетливо эластическая сеть (примерно 3-5 мин); 6) обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат: ядра клеток красные, эластические волокна темно-синие.

Окрашивание эластических волокон резорцин-фуксином можно сочетать с окрашиванием по методу Ван-Гизона для чего срезы сначала окрашивают резорцин-фуксином, ополаскивают в воде, дифференцируют спиртовым раствором хлористоводородной кислоты и переносят в воду, а затем окрашивают по Ван-Гизону.

Импрегнация ретикулярных волокон серебром по способу Фута. Приготовление раствора аммиачного серебра. На 5 мл 10% раствора нитрата серебра добавляют 4-5 капель 40% водного раствора NaOH. Образуется темно-бурый осадок гидрата окиси серебра. Осадок растворяют 25% раствором аммиака, приливая вначале 5-6-7 капель, а затем, осторожно добавляя по капле, каждый раз хорошо взбалтывая и ожидая 20-24 с, пока осадок не растворится. Аммиачное серебро употребляют только в свежеприготовленном виде.

Методика импрегнации:1) замороженные или депарафинированные срезы из дистиллированной воды переносят на 5-10 мин в 0,25% водный раствор перманганата-калия; 2) ополаскивают в водопроводной воде; 3) помещают на 15-30 мин до побеления срезов в 5% раствор щавелевой кислоты; 4) промывают в нескольких порциях дистиллированной воды 20-30 мин; 5) помещают на 48 ч (в темноте) в 2% раствор нитрата серебра; 6) быстро (3-5 с) ополаскивают в дистиллированной воде; 7) переносят на 15-30 мин в свежеприготовленный раствор аммиачного серебра (если срезы наклеены на стекло, капают аммиачное серебро на срез). Срезы при этом приобретают коричневатый оттенок; 8) ополаскивают в дистиллированной воде 5-10-15 с (слишком быстрое ополаскивание приводит в дальнейшем к излишнему потемнению среза, слишком продолжительное - к очень бледной окраске, следовательно, время ополаскивания нужно установить опытным путем; 9) помещают в 5% раствор формалина на водопроводной или дистиллированной воде на 15-30 мин; 10) основательно промывают в водопроводной воде; 11) переносят в 0,5-1% раствор хлорного золота на 5-10 мин (можно пользоваться раствором из расчета 1 капля 1% раствора хлорного золота на 1-2 мл дистиллированной воды и обрабатывать в течение 1 ч и более, пока срезы не станут белыми; 12) промывают в водопроводной воде 10-15 мин; 13) обрабатывают 2-3 мин в 5% водном растворе гипосульфита натрия; 14) тщательно промывают в проточной воде (от нескольких часов до 1 сут). В случае отсутствия хлорного золота можно увеличить продолжительность обработки темных срезов в растворе гипосульфита до 0,5-1-2 ч, контролируя под микроскопом через каждые 10-15 мин до желательной степени импрегнации.

Результат: ретикулярные волокна окрашиваются в черный цвет. Импрегнацию серебром по Футу можно комбинировать с окрашиванием гематоксилин-эозином по Ван-Гизону и другими методами.

Выявление соединительной ткани азур-2-эозином.

Выявление тучных клеток 0,1% раствором толуидинового синего в 30% спирте 1-2 мин. Краситель хорошего качества при этом дает красивую красно-фиолетовую окраску тучных клеток. Можно растворять толуидиновый синий в воде или в буферных растворах при низких значениях рН.