Вопросы для самопроверки

1. Чем отличаются включения от органелл?

2. Классификация включений.

3. Дайте характеристику клеточных включений: химический состав и роль в жизнедеятельности клеток.

4. Место локализации включений: цитоплазма или ядро?

5. Методы окрашивания трофических включений.

Занятие 7. Практическое занятие

Цели занятия:

1. Освоить методику приготовления давленых препаратов для изучения митоза растительных клеток.

2. Рассмотреть пигментные включения в клетках кожи головастика.

Задание 1. Научиться готовить микропрепарат – митоз корешка лука.

Наиболее доступным объектом для демонстрации митоза в учебном процессе является репчатый лук Alium сера, который имеет в соматических клетках 8 пар хромосом (2п-16).

Для приготовления препаратов можно использовать корешки либо проросшей луковицы, либо семян.

Для проращивания луковицы берут узкий стеклянный стаканчик, наполняют теплой водой и сверху помещают луковицу так, чтобы основание ее касалось поверхности воды. Когда образуются корни и длина их достигнет 2-3 см., воду меняют на теплую и спустя полчаса фиксируют корни.

Для этого ножницами отрезают кончики корней длиной около 1 см и сразу же погружают их в фиксатор, состоящий из 3 частей 96-процентного этилового спирта и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для фиксации используют плоскодонные пробирки с корковыми пробками или небольшие стеклянные бюксы с плотно притертыми крышками. Через полчаса – час зафиксированные корешки промывают 70% этиловым спиртом (в спирте такой же концентрации можно оставить корешки на длительное хранение).

В качестве красителей используют орсеин или кармин, которые растворяют в уксусной кислоте (уксусная кислота способна мацерировать ткань). Полученные растворы красителей называют ацетоорсеином или ацетокармином.

Техника приготовления ацетоорсеина или ацетокармина.

Смешивают 45 мл ледяной уксусной кислоты и 55 мл дистиллированной воды для получения 100 мл 45% уксусной кислоты. Добавляют орсеин, после взбалтывания и фильтрации ацетоорсеин готов к употреблению.

2 г кармина растворяют в 100 мл 45% уксусной кислоты. Растворение ведется в колбе с воронкой на водяной бане с подогревом в течение не менее 30 мин. После остывания и фильтрации раствор помещают в посуду с притертой пробкой. Красители имеют вишнево – малиновый цвет.

Для приготовления препарата зафиксированные кончики корней переносят из раствора спирта в фарфоровый тигелёк с красителями. Придерживая тигелёк пинцетом, подогревают несколько раз на спиртовке раствор красителя с корнями. Затем корешок вынимают из красителя и кладут его на предметное стекло в каплю 45-% уксусной кислоты.

Отрезают лезвием кончик корня (примерно 2-3 мм), где под чехликом находится меристема с делящимися клетками. Остальную часть корня удаляют со стекла. Накрывают покровным стеклом отрезанный кончик и сверху стекла кладут полоску фильтровальной бумаги. Указательным пальцем левой руки придерживают покровное стекло, чтобы оно не двигалось. Спичкой, находящейся в правой руке, постукивают по покровному стеклу, чтобы уложить клетки в один слой.

Удалив фильтровальную бумагу, просматривают препарат под микроскопом. Если получился хороший препарат, то края покровного стекла можно окантовать подогретым парафином или маникюрным лаком, чтобы сохранить на несколько дней для работы. Для окантовки покровное стекло придерживают указательным пальцем левой руки, чтобы оно не двигалось; правой рукой опускают кисточку (для рисования) в жидкий парафин и аккуратно обводят края покровного стекла кисточкой. Клетки окажутся заключенными в среду с 45% уксусной кислотой, где могут сохраняться в течение нескольких дней. Так получают давленные временные препараты.

Для того чтобы временный препарат перевести в постоянный, которым можно пользоваться несколько лет, необходим сухой лёд или термоэлектрический охлаждающий столик (ТОС).

Препарат помещают на поверхность сухого льда или охлаждающего столика. Через 1-3 минуты препарат замораживается, и покровное стекло становится неподвижным. Лезвием отделяют покровное стекло от предметного. Клетки остаются на одном из стёкол или на обоих. Стёкла опускают на несколько секунд для обезвоживания сначала в 96-%, а затем в 100-% этиловый спирт, затем в ксилол и заключают в канадский бальзам. Для этого наносят каплю бальзама на предметное стекло и осторожно накрывают чистым покровным стеклом. Рядом капают ещё одну каплю бальзама и помещают обезвоженное покровное стекло, на котором имеются клетки. Препарат сушат при комнатной температуре не менее суток.

На полученных препаратах можно легко найти клетки, зафиксированные в интерфазе и в различных фазах митоза: профаза, метафаза, анафаза и телофаза. Можно также определить митотический индекс (в %) по формуле:

МИ = А/В·100%,

где А – сумма клеток находящихся в различных фазах митоза;

В – общее число интерфазных и делящихся клеток.

Задание 2. Изготовить не окрашенный препарат из кожи головастика.

При малом увеличении микроскопа найти отростчатые пигментные клетки. При большом увеличении рассмотреть в пигментных клетках гранулы пигмента округлой и овальной формы. В центре клеток видны не окрашенные ядра.