Организация рабочего места студента – гистолога

Рабочий стол должен быть достаточно устойчивым, чтобы на нем можно было работать на микротоме, и хорошо освещенным. Его поверхность должна быть покрыта стеклом или пластмассой. На участке стола, где непосредственно производится окраска препа­ратов, под стекло целесообразно положить по одному листку белой и черной бумаги. На белом фоне лучше видны окрашенные срезы, на черном – неокрашенные.

Используется самая разнообразная лабораторная посуда, но ряд ее образцов необходим в каждой гистологической лаборатории. К ним относятся посуда для дистиллированной воды, банки с притер­тыми пробками, бюксы, химические стаканчики, биологические стаканчики, чашки Петри, мерная посуда, колбы, кристаллизато­ры, кюветы, пипетки. Необходимы также предметные и покровные стекла.

Для дистиллированной воды используется банка на шта­тиве с отводной трубкой. Банка для дистилли­рованной воды емкостью 2-3 л должна иметь в нижней части отверстие, к которому прикрепляют резиновую трубку с зажимом. Банку устанавливают на штативе, у основания которого под труб­кой ставят сосуд для слива воды или отработанных реактивов. Вме­сто банки с отводной трубкой можно использовать большую колбу, в пробку которой воткнуты две стеклянные трубки: изогнутая для взятия воды и прямая для поступления воздуха.

Банки с притертыми пробками используются для составления батарей для проводки материала при его заливке в парафин или целлоидин, для хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, целлоидиновых блоков в 70% спирте и других целей.

Бюксы представляют собой стеклянные стаканчики с притер­тыми крышками. Они могут быть низкими и высокими. Первые при­меняются для окрашивания целлоидиновых или замороженных сре­зов, хранения чистых покровных стекол и т. д., вторые – при состав­лении батарей для депарафинирования парафиновых срезов, для окра­шивания и заключения срезов, наклеенных на предметное стекло.

Биологические стаканчики бывают цилиндричес­кие, овальные или четырехугольные. Они снабжены крышечками. Наборы таких стаканчиков (как и высоких бюксов) вставляют в гне­зда специальных штативов и используют в качестве батарей для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах (см. ниже).

Колбы из химического стекла различной емкости с притер­тыми пробками и без них используют для приготовления и хранения различных красителей и реактивов. Для хранения и использования красителей очень удобны маленькие колбочки, в горлышко кото­рых вместо притертой пробки вставлена пипетка.

Чашки Петри представляют собой широкие плоские сте­клянные чашки с крышками, в которых производят окрашивание свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов и другие процедуры.

Для гистологической лаборатории необходима мерная посуда – цилиндры и мензурки различной емкости, а также пипетки – про­стые и мерные.

Кристаллизаторы – глубокие чашки из толстого стек­ла – применяют для мытья в проточной воде посуды и для других целей.

Часовые стекла необходимы для окрашивания свободно плавающих срезов, нуждающихся в контроле под микроскопом (на­пример, для импрегнации серебром нервной ткани).

Для канадского бальзама, в который заключают препараты (см. ниже), пригодны специальные баночки с пришлифованными крыш­ками-колпачками и со стеклянной палочкой внутри для взятия капли бальзама. Для хранения канадского бальзама может быть приспо­соблена любая невысокая баночка, в пробку которой воткнута сте­клянная палочка.

Рис.1: 1 – банка на штативе для дистиллированной воды с отводной трубкой и сосудом для слива; 2 – колба с двумя стеклянными трубками: для притока воздуха и для взятия воды; 3, 4 – банки с притер­тыми пробками; 5,6 – бюксы; 7 – чашка Петри; 8 – кювета для обработки нескольких препара­тов одновременно; 9, 10 – воронки; 11, 12 – мерные цилиндры; 13 – биологические стаканчики в штативе (батарея для депарафинирования, обезвоживания и пр.)

Для приготовления гистологических препаратов необходимы предметные и покровные стекла. Предметные сте­кла представляют собой стеклянные пластинки толщиной 1-2 мм, шириной 26 мм и длиной 76 мм, на которые помещают срезы. Покровные стекла – это пластинки толщиной 0,15-0,2 мм, кото­рыми покрывают срезы в процессе их заключения.

Вся лабораторная посуда и предметные стекла должны быть абсолютно чистыми. Всю посуду моют теплой водой с мылом, затем тщательно промывают проточной водой и ополаскивают дистилли­рованной водой. Если посуда должна быть особенно чистой, ее обрабатывают раствором бихромата калия и серной кислоты («хромпик»). Для приготовления раствора к 1000 мл горячей воды добавляют 100-200 мл насыщенного раствора бихромата калия (К₂Сr₂O₇) и после остывания раствора приливают 100 мл концентри­рованной серной кислоты. Этот раствор вливают в промываемую посуду и тут же выливают. Посуду ополаскивают 8-10 раз водопро­водной водой и не менее двух раз дистиллированной водой. Посуду и предметные стекла можно обрабатывать раствором бихромата калия и серной кислоты в течение нескольких дней, но в этом случае необходима последующая нейтрализация кислоты. После тщатель­ной промывки в проточной воде посуду переносят в слабоконцент­рированный раствор NаОН и затем снова промывают в течение 12-24 ч в проточной воде и ополаскивают дистиллированной водой. Предметные стекла после этого хранят в чистом спирте, а посуду сушат в сушильном шкафу.

Инструменты, используемые в гистологической лаборато­рии, включают пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажи­мы, корнцанг (рис. 2), шпатели, препаровальные иглы – прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необхо­димы при импрегнации серебром, когда металлическими иглами пользоваться нельзя. Гистологу необходимо также иметь спиртов­ку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу для этикетирования посуды, стеклянные иглы (иглы ежа или шипы расте­ний) для прикалывания объектов, если их нужно зафиксировать в растянутом состоянии.

Рис.2. Инструменты.

1– зажимы: а – Пеана, б – Кохера, в – корнцанг; 2 – скальпель; 3,4 – препаровальные иглы, 5,6 – шпатели.

Задание 1. Изучить основные этапы изготовления фиксированного и окрашенного гистологического препарата.

Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата:

1. Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления пре­парата. При этом учитываются следующие моменты:

-) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности – от живого объ­екта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа;

-) забор кусочков должен производиться острым инструментом, что­бы не травмировать ткани;

-) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка;

-) обязательно производится маркировка кусочка (указывается на­именование органа, номер животного, дата забора и т. д.);

2. Фиксация материала – необходима для остановки обменных процес­сов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми – спирты и формалин и сложными – раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и др. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также за­мораживанием (охлаждением в струе углекислого газа, жидким азотом и др.). Про­должительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа;

3. Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, органические смолы, желатин) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов;

4. Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме санном или ротационном, ультра­микротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электрон­ной микроскопии – монтируются на специальные сеточки (см. ниже);

5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроско­пии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые, нейтральные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями (эозин, конго красный, кислый фуксин, разные оранжевые), называют оксифильными (ацидофильными); основными красителями (гематоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий, азур) – базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Специальные красители взаимодействуют лишь с определёнными веществами, например, судан III и осьмиевая кислота выявляют жиры и жироподобные вещества. Просветление срезов (в ксилоле, толуоле).

Способность гистологических структур определенным образом окраши­ваться теми или иными красителями называется тинкториальными свойствами. Структуры, не реагирующие с красителями, называются хромофобными. Окрашивающиеся структуры являются хромофильными (базофильными, оксифильными). В ряде случаев для характеристики тинкториальных свойств используется название красителя, с которым реагируют или не реагируют гистологические структуры. Например, пиронинофильные – ок­рашенные пиронином, суданофобные – не окрашенные суданом и т.п. Иног­да структуры, имеющие специфический химический состав, меняют при окра­шивании цвет красителя. Такое тинкториальное свойство называется метахромазией.

6. Заключение срезов в консервирующую среду (баль­зам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

Гистологические препараты в зависимости от целей исследования могут быть временные, предназначенные для однократного изучения, и постоянные, которые могут сохраняться длительное время. В качестве среды, в которую заключают временный препарат, используют глицерин или воду. Временные готовят из прозрачных объектов, например соскоб с внутрен­ней поверхности слизистой оболочки щеки, мазок крови и т.д. Объект для ис­следования помещают на предметное стекло, на которое нанесена капля воды, физиологического раствора или глицерина, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. Для получения контрастного объекта иногда прибегают к слабому окрашиванию, используя безвредные (инертные) красите­ли: отвары ягод черники, смородины, корнеплода свеклы, чешуи лука или чер­нила, растворы йода, метиленового синего и т. д. Временные гистологические препараты просты в изготовлении, но не пригодны для тщательного изучения объекта, так как они быстро высыхают, неконтрастны, не имеют специфиче­ской окраски органоидов клетки. Временные препараты чаще всего использу­ются как предварительные.