Заливка в поливакс (карбовакс)

Для гистохимического изучения активности и гистотопографии ферментов в тканях общераспространенные методы заливки материала в парафин или целлоидин часто оказываются совершенно непригодными. Высокая температура, необходимая для заливки в парафин, вызывает сильное уплотнение материала и, кроме того, инактивацию многих ферментов. Длительное пропитывание объекта целлоидином также обусловливает инактивацию ферментов и значительное вымывание их из исследуемого материала. Во избежание этих недостатков в гистохимии ферментов в последнее время используют заливку тканей в поливакс или полиэтиленгликоль.

В качестве фиксатора лучше использовать формалин. После промывки материала на 30 минут помещают в 50% водный раствор поливакса с молекулярным весом 550. Затем его переносят в 75% раствор поливакса на 30 минут и, наконец, в его насыщенный раствор. Выдерживать материал в насыщенном растворе поливакса необходимо в тер­мостате при 37°.

В дальнейшем материал на 20-30 минут помещают в поливакс с молекулярным весом 1000 при температуре 37°. После этого исследуемый объект переносят в смесь равных объемов поливакса и «Нонекса».

Из указанной выше смеси материал переносят в «Нонекса» на 20 минут, после чего заливают. В летнее время рекомендуется использовать поливакс с молекулярным весом 4000.

Задание 1. Изучить различные методы окраски гистологических срезов.

Подготовка гистологического материала и приготовление парафиновых срезов

1. Фиксировать небольшие (0,5×0,5×1,0см) кусочки органов в 10% водном растворе формалина (или жидкости Буэна: 15 объемов насыщенного водного раствора пикриновой кислоты + 5 объемов формалина + 1 объем ледяной уксусной кислоты) - 24 часа. (Величина кусочка не должна превышать указанную, так как фиксатор за сутки проникает на глубину не более 0,2 см. Объем фиксатора должен превышать объем кусочка в 30-50 раз).

2. Промыть кусочки в проточной воде - 24 часа.

2. Обезводить кусочки (и частично уплотнить) в спиртах возрастающей крепости – 70°, 80°, 90°, 96° и 100° (в зависимости от характера материала от 6 до 24 часов).

2. Выдержать в ксилоле – 2 часа (в хлороформе – 24 часа) – это связано с тем, что парафин не соеди­няется со спиртом.

3. Выдержать в насыщенном растворе ксилола (или хлороформа) с парафином при температуре 37°С (в термостате) – 2 часа (можно до суток), чтобы избежать большого перепада температур.

4. Выдержать в чистом парафине (или содержащем до 5% пчелиного воска) при температуре 56-60 °С.

7. Залить материал парафином в бумажных или металлических формочках. Охладить в воде.

8. Вырезать кусочки и наклеить на деревянные кубики.

9. Изготовить тонкие (5-6 мкм) срезы на микротоме (санном или роторном).

10. Поместить срезы на предметные стекла, смазанные яичным белком с глицерином.

11. Расправить срезы на капле дистиллированной воды при легком подогревании.

Подсушить срезы в термостате при температуре 37°С.

Окрашивание срезов гематоксилин-эозином

1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.

10. Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.