1. Приготовление раствора ферментного препарата

А. Для кислых протеиназ (рН реакционной смеси 2,5±0,2).

0,5 г исследуемого препарата отвешивают на аналитических весах, тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора рН 2,5. Затем количественно переносят в мерную колбу на 50 см³ и доводят этим же универсальным буферным раствором объем жидкости до метки. Последующие разведения производят 0,1 М универсальным буферным раствором рН 2,5.

Б. Для кислых протеиназ (рН реакционной смеси 5,5±0,2).

0,05-0,5 г исследуемого препарата отвешивают на аналитических весах, тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора рН 5,5. Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 см³ и доводят объем раствора до метки 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 5,5.

В. Для нейтральных протеиназ (рН реакционной смеси 7,2±0,2).

0,05-0,5 г исследуемого препарата тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора рН 7,2. Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 см³ и доводят объем раствора до метки 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 7,2. Последующие разведения производят 0,1 М универсальным буферным раствором рН 7,2.

Г. Для щелочных протеиназ (рН реакционной смеси 9,5±0,2).

0,05-0,5 г исследуемого препарата тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством 0,1 М универсального буферного раствора рН 9,5. Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 см³ и доводят объем раствора до метки 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 9,5. Последующие разведения производят 0,1 М универсальным буферным раствором рН 9,5.

2. Приготовление 2%-го раствора казеината натрия (субстрат)

А. Для кислых протеиназ (рН 2,5).

2 г сухого казеината натрия растворяют в 90 мл 0,01 М буферного раствора с рН 5,5. Затем раствор доводят до рН 2,5 добавлением 3,0-3,5 см³ 1 н НС1.

При подкислении раствора казеината натрия соляной кислотой ниже рН 5,1 наблюдается некоторое помутнение раствора (образование мелких хлопьев), а при рН 4,5 отмечается выпадение крупных хлопьев и резкое разделение раствора на две фазы – осадок и растворитель.

При подкислении раствора казеината натрия соляной кислотой до рН 3,1-3,2 происходит постепенное растворение хлопьев, а при рН 3,00-3,05 опять получается однородный раствор, вид которого не меняется при дальнейшем добавлении кислоты до рН 2,5 и ниже.

Добавление соляной кислоты (до рН 3,0) следует производить быстро, при интенсивном перемешивании раствора. При дальнейшем подкислении раствора до рН 2,5 кислота вносится по каплям.

Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью на 100 см³ и доводят объем до метки 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 2,5.

Б. Для кислых протеиназ (рН 5,5).

2 г сухого казеината натрия растворяют в 90 см³ 0,1 М универсального буферного раствора с рН 5,5, после чего раствор доводят до рН 5,5 добавлением нескольких капель 1 н НС1. Затем раствор переносят в мерную колбу на 100 см³ и доводят объем раствора до метки 0,1 М универсальным буферным раствором с рН 5,5.

В. Для нейтральных протеиназ (рН 7,2).

2 г сухого казеината натрия растворяют в 90 см³ 0,1 М универсального буферного раствора с рН 7,2. Если рН полученного раствора ниже 7,2, то добавляют по каплям 1 н NaOH до получения раствора с рН 7,2. Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью на 100 см³ и объем раствора доводят до метки этим же буфером.

Г. Для щелочных протеиназ (рН9,5).

2 г сухого казеината натрия растворяют в 90 см³ 0,1 М универсального буферного раствора с рН 9,5 и рН раствора доводят 1 н NaOH до 9,5. Затем раствор переносят в мерную колбу емкостью на 100 см³ и объем раствора доводят до метки этим же буфером.

Для сокращения времени растворения казеината натрия раствор готовят при нагревании до 70° С на магнитной мешалке.

Срок хранения 2%-го раствора казеината натрия не более 2 суток (в холодильнике).