4. Сущность метода определения амилолитической активности ферментов.

5. Характеристика амилолитических ферментов

6. Применение амилолитических ферментов в пищевой промышленности.

Лабораторная работа № 5 определение протеолитической активности ферментных препаратов модифицированным методом ансона

Цель работы: освоить метод определения протеолитической активности ферментных препаратов.

Теоретическое положение

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользуются производными понятиями удельной и молярной активности.

Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в секунду, принято называть числом оборотов, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента).

Если фермент содержит характерную простетическую группу или несколько каталитических центров, которые поддаются измерению, его активность можно выразить в величинах активности каталитического центра. Такая активность будет соответствовать молекулярной активности, если молекула фермента имеет один активный центр; если же число каталитических центров n, то активность одного центра будет в n раз меньше молекулярной.

Активность условного препарата. В технологии ферментов помимо общепринятых понятий об активности ферментных препаратов принято пользоваться понятием активности условного ферментного препарата. Это необходимо для оценки работы предприятия, сравнения его с другими аналогичными заводами, т. е. для сопоставления показателей по всем видам выпускаемой продукции. Для осуществления этого пересчета предполагают, что предприятие выпускает товарную продукцию в виде стандартного препарата с точно определенной активностью, измеряемой по основному ферменту в стандартных единицах в препарате на единицу массы препарата. Активность основного фермента в таком стандартном условном препарате устанавливается нормативами и называется активностью условного препарата.

За 1 усл.т ферментного препарата принимается 1 т препарата со стандартной активностью. Для пересчета выработанной товарной продукции в условные тонны можно пользоваться формулой [5.1]:

Qусл = Qтов*Аф/Аусл,

[5.1]

где: Q_усл – количество условного препарата, т;

Q_тов – количество товарного препарата, т;

А_ф – фактическая активность товарного препарата, ед/г;

А_усл – активность условного препарата, ед/г.

Протеолитическая активность (ПС) характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г препарата.

За единицу протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30°С превращают в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеинат натрия в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в ед/г.

Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона (по ГОСТ 20264.2) основано на гидролизе белка казеината натрия препаратом фермента, находящимся в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Активность бактериальных протеиназ определяют при следующих значениях рН: 2,5 ± 0,2 – кислые протеиназы; 7,2 ± 0,2 –нейтральные протеиназы; 9,5 ± 0,2 –щелочные протеиназы.

Аппаратура, оборудование и материалы:

Приборы и оборудование – ультратермостат, фотоэлектрокалориметр, весы аналитические, магнитная мешалка, плитка, водяная баня.

Реактивы и материалы –0,01 М, 0,1 и 0,5 М универсальный буферный раствор; 0,3 М раствор ТХУ; 1н НС1; 0,2 н НС1; 0,5 М NaCO₃; реактив Фолина (1:2); протеолитические ферментные препараты (пепсин, панкреатин, сычужный фермент), тирозин, казеинат натрия, 1 н уксусная кислота; 1 н уксуснокислый натрий; бумажные фильтры;

Посуда – пробирки, химические стаканы емк. 100 см³, мерные колбы емкостью 50 см³ , мерные колбы емкостью 100 см³ , стеклянные палочки, воронки

Порядок выполнения работы: