Лабораторная работа № 4 определение амилолитической активности ферментных препаратов

Цель работы: освоить метод определения амилолитической активность ферментных препаратов.

Теоретическое положение

Ферменты являются веществами белковой природы, поэтому в смеси с другими белками определить их количество невозможно. Наличие определенного фермента в данном препарате может быть установлено по результатам той реакции, которую катализирует фермент, т. е. по количеству образовавшихся продуктов реакции или уменьшению исходного субстрата. В количественном выражении условно активность фермента определяется по начальной скорости ферментативной реакции. Начальная скорость зависит от многих факторов, наиболее важные из них - температура, концентрация субстрата, рН реакционной смеси и время от начала реакции. Поэтому по предложению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза были приняты правила определения активностей препаратов и их выражения в единицах активности.

Стандартная единица активности. Эта величина для любого фермента обозначает то его количество, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата в минуту (мкмоль/мин) при заданных регламентированных условиях. На русском и немецком языках эта единица обозначается буквой Е, на английском, французском, итальянском и испанском языках - U. Часто количество субстрата нельзя выразить числом микромолей, т.к. точно не известна масса молекулы, например, при действии на белок, крахмал, пектин, целлюлозу. В этих случаях определяют микроэквивалент затронутых реакцией групп. Так, при гидролизе белка учитывают не число прогидролизированных молекул, а число образовавшихся свободных карбоксильных и аминных групп, т.е. число расщепленных пептидных связей; при гидролизе крахмала и полисахаридов – число прогидролизованных глюкозидных связей и т.д. Если количество прореагировавшего субстрата очень мало или велико, допускается выражение результатов в миллиединицах (мЕ или мU) и килоединицах (кЕ и кU).

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое определение ферментной единицы катал (кат, kat); 1 кат – каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1с (1 моль/с). Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль *с^-1 = 60 моль*мин^-1 = 60*10⁶ мкмоль*мин^-1 = 6*10⁷ Е; или 1 Е = 1 мкмоль*мин^-1 = (1/60) мкмоль*с^-1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 Е фермента соответствует 16,67 нкат.

Комиссия по ферментам рекомендовала придерживаться определенных условий при установлении активности фермента: проведение измерения единиц фермента при 30° С и определять активность по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента и соответствует кинетике реакции нулевого порядка. Концентрации субстрата, фермента и рН выбирают оптимальными для данного фермента.

Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.

За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принято такое количество ферментов, которые в строго определенных условиях температуры, рН и времени действия, катализируют до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

Аппаратура, оборудование и материалы:

Приборы и оборудование – ультратермостат, фотоэлектрокалориметр, весы аналитические, магнитная мешалка, плитка, водяная баня.

Реактивы и материалы – ацетатный буферный раствор рН 4,7; 01н НС1; 0,2 н НС1, 0,1 н НС1; 0,5 М NaCO₃; амилолитические ферментные препараты, дистиллированная вода; крахмал, 1%- крахмал; 1 н уксусная кислота; 1 н уксуснокислый натрий; основной раствор йода; бумажные фильтры;

Посуда – пробирки, химические стаканы емк. 50 см³, мерные колбы емкостью 100 см³ , мерный цилиндр 50 см³, на мерные колбы емкостью 100 см³ , стеклянные палочки, пипетки на 2 см³, 5 см³,10 см³.

Порядок выполнения работы

Сущность метода. Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы.

Ход работы: