Література Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. - Київ-Тернопіль: Укрмед- книга, 2000. - 508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологичес­­­кая химия: Практикум. - К.: Вища шк., 1985. - 212 с.

3. Будова та властивості білків, ферментів, вітамінів і гормонів. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 31 с.

4. Обмін речовин та його показники. Методичні розробки практичних занять з біологічної хімії. За ред. Ю.В.Хмелевського. – Київ: НМУ. – 1992. – 37 с.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник .-Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 2 т. – М.:Мир, 1982.

Тема заняття № 3. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

Цілі заняття:

• Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що протікають у фермент-субстратному комплексі.

• Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

• Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

• Аналізувати механізм дії ферментів на прикладі хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Теоретичні питання

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

• за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;

• за кількістю субстрату, що використовується;

• за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД);

• спектрофотометричні методи визначення активності ферментів;

• візуалізація результатів ферментативної реакції.

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

• залежність швидкості реакції від концентрації субстрату;

• утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;

• рівняння Міхаеліса-Ментен;

• смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).

4. Вираз ферментативної реакції в подвійних зворотних величинах. Рівняння Лануівера-Берка.

5. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

• ефекти зближення та орієнтації;

• ефекти основно-кислотного каталізу;

• ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

6. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Практичні роботи

Завдання 1. Кількісне визначення активності амілази слини за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 %-го розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості 0,1%-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37^оС протягом 30 хв. В нормі амілазна активність слини – А = 160 – 320 одиниць.

Хід роботи. У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл води. У першу пробірку додають 1 мл розведеної в 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї – в третю, таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менше, ніж у попередній. Потім в усі пробірки додають по 2 мл 0,1%-го розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 37°С на 30 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1%-ний розчин йоду в 0,2%-ному розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності слини:

Показник	№ пробірки
	1	2	3	4	5	6	7
Розведення слини (сечі)	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280
Кількість 0,1%-го розчину крохмалю	2 мл	2 мл	2 мл	2 мл	2 мл	2 мл	2 мл
Забарвлення після додавання йоду
Остання пробірка з розчином жовтого кольору

Розрахунок. Для розрахунку активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/160 мл слини розщеплює 2 мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1мл слини розщеплює - Х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки X= ^{1 ×2} = ^2×160 = 320 мл

^{1/160 1}

А отже: А (амілазна активність) = 320 одиниць.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі.

Завдання 2. Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Метод виявлення та кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5 мл сироватки крові № 1, у другу – 0,5 мл сироватки крові № 2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними сироватками додають по 2 мл 2% -го розчину ацетилхоліну та інкубують при 37^оС 10 хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1 М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення.

Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Заповнюють таблицю:

Досліджувана сироватка	Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування, в мл	Висновок
№ 1
№ 2

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності холінестерази сироватки крові використовується для діагностики ряду захворювань, зокрема інфаркту міокарда, вірусного гепатиту, злоякісних пухлин печінки, тощо. Перераховані захворювання супроводжуються значним зниженням активності холінестерази сироватки крові.