Определение активности рибонуклеазы

Принцип метода Рибонуклеаза — это фермент, расщепляющий полимерную молекулу РНК на низкомолекулярные фрагменты, количественное определение которых проводят при 260 нм.

Реактивы: 1) раствор дрожжевой РНК (1 мг/мл) в ацетате натрия (0,1 моль/л); 2) водный раствор панкреатической РНКазы, 0,2%; 3) спирто-магниевый осадитель — 80% раствор этанола, содержащий 0,01 моль/л MgСI₂.

Ход работы К 0,4 мл раствора дрожжевой РНК в центрифужную пробирку вносят 0,2 мл раствора РНКазы (в качестве источника фермента можно использовать 5% водные гомогенаты тканей объемом 0,5 мл, а также разбавленную в 10 раз слюну), перемешивают и помещают в термостат на 30-60 мин при 37 °С. В пробирку вносят 1 мл спирто-магниевого осадителя и помещают на ледяную баню. Через 1 ч образуется осадок РНК, который удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. Затем отбирают 2—3 пробы надосадочной жидкости (0,5 мл), прибавляют к каждой по 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм против воды. Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контрольной (_А₂₆₀) служит показателем активности РНКазы и используется для расчета активности фермента по формуле

А=А₂₆₀*V₁V₂/V₃tW, где V₁— объем пробы после разбавления; V₂ объем пробы после осаждения РНК спирто-магниевым раствором; V₃— объем надосадочной жидкости; _А₂₆₀ — прирост оптической плотности опытной пробы по отношению к контрольной; t — время инкубации, мин; W— масса белка (фермента) в пробе, мг.

Результат: ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод______________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Определение активности дезоксирибонуклеазы

Принцип метода При действии дезоксирибонуклеазы на ДНК образуются кислотные группы, которые обесцвечивают индикатор феноловый красный,

Реактивы: 1) раствор NаСI — 0,14 моль/л; 2) субстратный раствор (1мл— 2 мг раствора натриевой соли ДНК), 1 мл раствора сульфата натрия (0,05 моль/л) и 0,4 мл раствора фенолового красного (10 мг фенол-сульфофталеина, 0,28 мл 0,1 М раствора NaОН, 3 мл 96% этанола, 40 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,55). Смесь заливают водой до объема 100 мл, рН субстратного раствора (2,4 мл) доводят до 7,55, добавляя 0,01 н. раствор NaОН, и доливают водой до 3 мл.

Ход работы В 10 мл охлажденного раствора МаС1 растирают 15 мг ткани. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 10 000 об/мин. К 3 мл субстратного раствора прибавляют 1 мл полученной надосадочной жидкости ферментного раствора. Смесь помещают в кювету спектрофотометра. Измеряют оптическую плотность при 558 нм (зеленый светофильтр) в течение 10-15 мин с интервалом в минуту. Активность фермента оценивают графически. По оси абсцисс откладывают время в минутах, а по оси ординат — значения оптической плотности. Активность фермента выражают снижением оптической плотности комплекса ДНК и красителя, разрушающегося в результате гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты за первые 3 мин инкубации.

Результат: ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод______________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________