XI.Тема синтез белка Количественное определение днк колориметрическим методом

Принцип метода Метод основан на способности дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, давать синее окрашивание с дифениламиновым реактивом.

Реактивы: дифениламиновый реактив, 1 % раствор; 2) водный раствор ДНК.

Ход работы 1.В опытную пробирку наливают 1 мл водного раствора ДНК и 2 мл дифениламинового реактива. В контрольную пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды и 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность при красном светофильтре (КФК, кюветы шириной 5 мм). 2. Построение калибровочного графика. В три пробирки помещают по 1 мл раствора ДНК с концентрациями 50, 100 и 200 мкг/мл соответственно. Добавляют в каждую пробирку по 2 мл дифениламинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность. Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентрации использованных растворов ДНК, а на оси ординат — значения оптической плотности.

Результат: ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод______________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Количественное определение рнк колориметрическим методом

Принцип метода Метод основан на цветной реакции орцинового реактива с пентозой, входящей в состав РНК.

Реактивы:

1) орциновый реактив (50 мг FеС1₃*6Н₂О растворяют в 250 мл концентрированной НС1 и перед опытом к нужному количеству этого раствора добавляют орцин из расчета 4,76 мг/мл); 2) водный раствор РНК.

Ход работы

1. В опытную пробирку помещают 1 мл раствора РНК и 1 мл орцинового реактива. В контрольную пробирку помещают 1 мл дистиллированной воды и 1 мл орцинового реактива. Обе пробирки нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность при красном светофильтре.

2. В три пробирки наливают по 1 мл раствора РНК с концентрациями 50, 100 и 200 мкг/мл и по 1 мл орцинового реактива. Пробы нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. После охлаждения измеряют их оптическую плотность при красном светофильтре. Построение калибровочного графика аналогично предыдущей работе.

Результат: ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод______________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот

Принцип метода В основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.

Реактивы:

НС1О₄, 0,2 н. и 0,5 н. растворы.

Ход работы 100—200 мг измельченной на холоду ткани помещают в центрифужную пробирку с 5—10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при охлаждении. Центрифугат отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кислотой. Такая обработка необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. К осадку добавляют 5—10 мл 0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. Эта процедура необходима для количественной экстракции нуклеиновых кислот из исследуемой ткани и кислотного гидролиза. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют. Осадок подвергают повторной экстракции 0,5 н. раствором хлорной кислоты. Гидролизаты объединяют, учитывают объем и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против 0,5 н, раствора хлорной кислоты. При необходимости гидролизат разводят тем же раствором.

Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле: C_{фосфора} = (А₂₇₀-А₂₉₀)/0,19 мкг- где 0,19 — значение _А (А₂₇₀ - А₂₉₀), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10,3: С_нк = С_{фосфора} *10,3 (мкг).

Результат: ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод______________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________