Лабораторная работа № 7 Количественное определение активности фермента Действие амилазы на крахмал

Принцип метода. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала (гликогена) через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, а затем глюкозы.

(С₆Н₁₀О₅)n→(С₆Н₁₀О₅)х→y С₁₂Н₂₂О₁₁→n С₆Н₁₂О₆

Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску или вообще не окрашиваются.

Поэтому, если к раствору крахмала прибавить раствор слюны и через определенные промежутки времени добавлять в пробы 1% раствор йода, то жидкость сначала приобретает синий цвет, а затем — фиолетовый, красный, оранжевый и желтый. Это объясняется тем, что амилаза слюны расщепляет крахмал, образуя ряд промежуточных продуктов. Амилодекстрины и эритродекстрины дают с йодом гамму цветов—от фиолетового до оранжевого. Мальтодекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают.

Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — могут быть обнаружены реакцией Троммера

Ход работы. Сначала готовят раствор амилазы. Для этого собирают небольшое количество слюды (примерно 0,5 мл) и разводят ее дистиллированной, водой. Разведенную слюну используют в качестве источника амилазы. Далее берут 7 пробирок.

В каждую пробирку наливают из бюретки по 1 мл раствора крахмала и добавляют по 1 мл раствора слюны. Затем в пробирки с интервалами по 5 минут добавляют по 1-2 капле раствора Люголя (содержит йод). Пробирки встряхивают, отмечают цвет раствора.

Результат:

№ пробирки	Время инкубации (мин)	Окраска
1	0
2	5
3	10
4	15
5	20
6	25
7	30

Вывод: ______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

IV.Тема нуклеиновые кислоты Лабораторная работа № 8 Кислотный гидролиз нуклеопротеинов.

Принцип метода. Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. В кислой среде происходит ослабление ионного взаимодействия между белком и нуклеиновыми кислотами и их разделение. При последующем нагревании гидролиз протекает до аминокислот, пуриновых или пиримидиновых оснований, рибозы или дезоксирибозы, фосфорной кислоты.

Реактивы:

1. пекарские дрожжи;

2. 10% раствор H₂SO₄;

3. 10% раствор NaOH;

4. 1% раствор CuSO₄;

5. аммиак концентрированный;

6. 1% раствор нитрата серебра;

7. 1% спиртовой раствор тимола (или нафтола);

8. концентрированная H₂SO₄;

9. 30% раствор NaOH;

10. 7% раствор СuSO_4;

11. молибденовый реактив;

12. 1% раствор дифениламина.

Ход работы: 1 г пекарских дрожжей помещают в круглодонную колбу. Добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты, 20 мл воды и закрывают пробкой с обратным холодильником. Кипятят 40-50 мин. Охлаждают, переливают в цилиндр. Доводят до первоначального объема и фильтруют.

С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:

Проба на пептиды: 5 капель гидролизата смешивают с 10 каплями 10% раствора NaOH и 1 каплей 1 % раствора CuSO₄. Содержимое окрашивается в розовый цвет.

Проба на пуриновые основания: к 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного аммиака и 5 капель 1 % раствора нитрата серебра. Через 3-5 амин появляется бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.

Проба на пентозы (реакция Молиша): к 10 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли 1% спиртового раствора тимола (или нафтола). Содержимое перемешивают и по стенке приливают 20 капель концентрированной серной кислоты.

При встряхивании образуется красное окрашивание продукта конденсации фурфурола с тимолом, образовавшимся из пентозы.

Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу: к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30% раствора NaOH и 1-3 капли 7% раствора СuSO₄ до появления неисчезающей мути Cu(OH)₂ перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I).

Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином: дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое - с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание.

Проба на фосфорную кислоту: к 3-5 каплям гидролизата прибавляют 20 капель молибденового реактива (7,5 г молибдена аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты с относительной плотностью 1,2) и кипятят несколько минут. Развивается желтое окрашивание. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.

Результат: ___________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________