6.5. Тесты межвидовой дифференциации

патогенных для человека вибрионов

Определение галофильности вибрионов

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают в 1%-ю пептонную воду с 3% натрия хлорида. Через 3 - 4 ч инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С переносят строго по 1 капле выросшей культуры в пептонную воду без NaCl, с 7 и 10% натрия хлорида. Через 18 - 20 ч инкубации оценивают рост культур по помутнению среды.

К негалофильным относятся V. cholerae и V. mimicus, для роста которых достаточны следовые количества соли в среде. Вибрионы остальных видов, за исключением некоторых штаммов V. fluvialis и V. metshnikovii, не растут в 1%-й пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к значительным его концентрациям.

Определение способности вибрионов к росту при разных температурах

Способность вибрионов к росту при температуре 4; 20; 30; 35; 40; 45 и 50 °С выявляют при посеве суточных культур в 1%-ю пептонную воду с 0,5% натрия хлорида для негалофильных вибрионов и с 1,5 - 2,0% натрия хлорида для галофильных вибрионов. Наличие роста оценивают визуально в сравнении с контролем. Наблюдают за посевами ежедневно в течение 2 недель.

Определение нитратредуктазы

а) Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1% азотно-кислого калия. После 2-х суток инкубации при температуре (37,0 +/- 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.

б) К 1 - 2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1% KNO

3

добавляют 3 - 5 капель реактива, представляющего собой смесь

равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и

12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции

бульон окрашивается в красный цвет.

Определение бета-галактозидазы

Суточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10% лактозы. Посевы инкубируют 1 - 2 суток при температуре (37 +/- 0,5) °С. Петлю выросшей культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора О-нитрофенил-b-D-галактопиранозита (ONPG) и помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °С. Реакцию учитывают через 20 мин., 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном - остается бесцветной.

6.6. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов

6.6.1. Определение гемолитической активности (по Грейгу)

К 1 мл 18 - 24-часовой культуры, выращенной в 4 - 5 мл мясопептонного бульона, добавляют 1 мл 1%-й взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь бульонной культуры и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при температуре (37,0 +/- 0,5) °С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч, окончательный - на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева "смеси" на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3-х месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2 - 3 тыс. об./мин. в течение 15 мин., надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты отмывают 0,9%-м раствором хлорида натрия 2 - 3 раза с промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1%-ю взвесь в 0,9%-м растворе хлорида натрия, которую можно хранить при температуре 4 °С 2 - 3 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом (рецепты консервантов - см. раздел 7).X