5.2.4. Идентификация гена mecA

Показаниями для проведения молекулярно-генетической индикации MRSA служат:

- сомнительные результаты при определении чувствительности к оксациллину с помощью фенотипических методов;

- тяжелые случаи ВБИ (бактериемия, сепсис и т.д.), а также случаи низкой клинической эффективности при использовании оксациллина или антибиотиков цефалоспоринового ряда при лечении осложнений, вызванных S.aureus;

- выделение клинических изолятов S.aureus, устойчивых к 2 - 3 антибиотикам, помимо бета-лактамов, но чувствительных к оксациллину при определении дискодиффузионным методом;

- увеличение частоты ВБИ, вызванных S.aureus.

Используются следующие праймеры:

прямой праймер: MecA-F 5'-ACT GCT АТС САС ССТ САА АС-3';

обратный праймер MecA-R 5'-CTG GTG AAG TTG ТАА ТСТ GG-3'.

Размер генного продукта - 163 н.п. Состав реакционной смеси стандартный. Концентрация праймеров - 12 - 15 пкм/мл.

Режим амплификации N 1:

94 °С - 2 мин., 35 циклов амплификации (94 °С - 30 сек., 57 °С - 30 сек., 72 °С - 20 сек.), заключительная элонгация при 72 °С в течение 5 мин. Ориентировочное время амплификации 1 час 15 мин.

5.2.5. Генотипирование

Показания для проведения генотипирования MRSA

1. В стационарах, где MRSA выделены впервые.

Подлежат типированию все выделенные клинические изоляты с целью выявления источника эпидемического штамма и предотвращения его дальнейшего распространения.

2. В стационарах, где MRSA являются эндемичными.

А) В отделениях с высоким риском передачи инфекции: отделениях интенсивной терапии, хирургических, травматологических и ожоговых подлежат типированию все клинические изоляты.

При возникновении вспышки внутрибольничной инфекции типированию подлежат изоляты, выделенные и от колонизованных больных.

Б) Подлежат типированию все клинические изоляты, выделенные от пациентов при бактериемии, пневмонии, септическом шоке, а также от носителей среди лиц из числа медицинского персонала и из окружающей среды.

В) В родовспомогательных учреждениях подлежат типированию все изоляты.

Схема генотипирования представлена на рисунке 4.

┌───────────────┐ ┌──────────────┐ ┌───────────────────┐

│Исследование │ │ Определение │ │ Идентификация │

│гена, входящего│ │ структурного │ │генетических линий │

│в состав хромо-├─────>│ полиморфизма ├─────>│ S.aureus │

│сомного "бэк- │ │ коагулазного │ │ │

│граунда" │ │ гена │ │ │

└───────────────┘ └──────────────┘ └───────────────────┘

┌──────────────┐ ┌───────────────────┐

│ Определение │ │ Идентификация │

│ структурного │ │ эпидемических │

┌───>│ полиморфизма ├─────>│ клонов MRSA │

┌───────────────┐ │ │ mec ДНК │ │ │

│ Исследование │ │ └──────────────┘ └───────────────────┘

│генов, входящих│ │ ┌───────────────────┐

│в состав геном-├─┤ │Характеристика эпи-│

│ных островов │ │ ┌──────────────┐ ┌───>│демических клонов │

└───────────────┘ │ │Идентификация │ │ │по наличию генов │

└───>│генов патоген-│ │ │патогенности │

│ности ├─┤ └───────────────────┘

└──────────────┘ │ ┌───────────────────┐

│ │Идентификация │

└───>│отдельных эпидеми- │

│ческих штаммов │

└───────────────────┘

Рис. 4. Генотипирование MRSA

5.2.5.1. Исследование полиморфизма структуры

коагулазного (соа) гена

Исследование полиморфизма структуры коагулазного гена включает два этапа.

1) Определение величины размеров ампликонов, полученных при амплификации фрагмента коагулазного гена, расположенного в 3'- конце гена между 1513 и 2188 нуклеотидами.

Используют следующие праймеры:

прямой праймер Coa1 - 5' ATA GAG ATG CTG GTA CAG G 3';

обратный праймер Coa2 - 5' GCТ TCC GAT TGT TCG ATG C 3'.

Рабочая концентрация праймеров составляет 12 - 15 пкм/мкл.

Режим амплификации N 1

Размер ПЦР-продукта коагулазного гена может варьировать от 400 до 800 н.п. Вариабельность размеров ампликонов указывает на существование структурных различий коагулазного гена у исследуемых изолятов.

2) Рестрикционный анализ продукта амплификации с использованием рестриктазы Cfo1.

На рис. 5 представлена схема образцов рестрикции стандартных международных штаммов как метициллинчувствительных (группа PS штаммов - штаммы, предназначенные для размножения бактериофагов из коллекции Международного набора), так и эпидемических штаммов EMRSA.

Н.п.

│ ---

│ --- --- --- --- ---

100 ─┼─

│ --- --- --- --- --- ---

│ --- --- --- ---

│

200 ─┼─ --- --- --- --- ---

│

│

│

300 ─┼─ --- --- --- --- ---

│

│

400 ─┼─

│

│

500 ─┼─ --- ---

│

│

600 ─┼─ ---

│

700 ─┼─

│

800 ─┼─

│

900 ─┼─

│

│

1000 └─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼─

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 5. Схема образцов рестрикции штаммов

при использовании рестриктазы Cfo1

Примечание:

1 EMRSA-3

2 EMRSA-15*

3 PS 29, EMRSA-16*

4 PS 52, EMRSA-1, EMRSA-4, 7, 9, 11*

5 PS 6, PS 53, EMRSA-12, EMRSA-2, 5, 6, 8, 13, 14*

6 PS 95, Airdale-16 вариант EMRSA-16*

7 PS 94, PS 96

8 EMRSA-2

9 PS 42E

10 PS 71

Результаты рестрикции представлены в работе (34).X

Рис. 6. Электрофореграмма рестрикции эндонуклеазой Cfo1

коагулазного гена клинических изолятов MRSA

выделенных в стационарах России

Не приводится.

Анализ результатов рестрикции позволяет сравнивать исследуемые изоляты между собой, сделать ориентировочное заключение о генетической гетерогенности исследуемой популяции клинических изолятов, сопоставить их с данными рестрикции коагулазного гена международных штаммов.

5.2.5.2. Идентификация типов SCCmec

Определение типа SCCmec осуществляют на основании результатов амплификации с использованием 7 разных пар праймеров, выявляющих структурные элементы кассет различных типов.

Стратегия идентификации типов SCCmec.

На первом этапе определяют специфичность набора генов,

кодирующих синтез рекомбиназ (тип ссr 1, 2, 3) с использованием

3-х пар праймеров: бета и альфа , бета и альфа , бета и альфа ,

с 1 с 2 с 3

соответственно. Праймер бета с является общим для определения

генов ccrB1, ccrB2 и ccrB3.

Этот этап типирования позволяет сделать предварительное заключение о возможном присутствии в исследуемом изоляте SCCmec того или иного типа. Следующим этапом является определение набора генов, входящих в состав комплекса mec (класс А или класс В) с использованием праймеров mI3 и mI4, а также IS5 и mА6. Результаты амплификации, полученные с использованием 5 пар праймеров, позволяют идентифицировать присутствие SCCmec I, II и III типов.

Для определения возможного присутствия SCCmec типа IV, в случае идентификации набора mec класса В и набора ccr типа 2, дополнительно проводят амплификацию с праймерами, выявляющими области J1a или J1b.

Следует иметь в виду, что в ряде изолятов могут присутствовать "неправильные" кассеты SCCmec, а также дополнительные кассеты.

Состав реакционной смеси стандартный.

Праймеры альфа , альфа , альфа , бета , mI4, mI3, IS5, mA6

1 2 3 c

используются в концентрации 15 пкм/мкл. Праймеры 4a1, 4a2, 4b1,

4b2 используются в концентрации 15 - 20 пкм/мкл.

Режим амплификации N 2: предварительная денатурация при 94 °С - 2 мин., 30 циклов амплификации (94 °С - 30 сек., 50 °С - 1 мин., 72 °С - 2 мин.).

Ориентировочное время амплификации - около 2,5 часов.

Используемые праймеры представлены в таблице 2.

Таблица 2

НАБОРЫ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТИПОВ SCCmec

┌───┬───────────┬────────┬────────────────────────────┬──────────┐

│ N │Тип иденти-│Название│ Нуклеотидная │ Размер │

│п/п│фицируемого│праймера│ последовательность │ампликонов│

│ │элемента │ │ │ н.п. │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│1 │Ccr тип I │бета │5'-ATT GCC TTG ATA ATA GCC │700 │

│ │ │ с │I TCT-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │альфа │5'-AAC СТА TAT CAT CAA TCA │ │

│ │ │ 1 │GTA CGT-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│2 │Ccr тип II │бета │ │1000 │

│ │ │ с │ │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │альфа │5'-TAA AGG CAT CAA TGC АСА │ │

│ │ │ 2 │AAC ACT-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│3 │Ccr тип III│бета │ │1600 │

│ │ │ с │ │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │альфа │5'-AGC TCA AAA GCA AGC AAT │ │

│ │ │ 3 │AGA AT-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│4 │Класс А mec│mI4 │5'-CAA GTG AAT TGA AAC CGC │180 │

│ │Генный │ │CT-3' │ │

│ │комплекс │ │ │ │

│ │mecI │ │ │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │mI3 │5'-CAA AAG GAC TGG ACT GGA │ │

│ │ │ │GTC CAA A-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│5 │Класс В │IS5 │5'-AAC GCC ACT CAT AAC ATA │2000 │

│ │mec (IS272-│ │AGG AA-3' │ │

│ │mecA) │ │ │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │mA6 │5'-TAT ACC AA CCC GAC │ │

│ │ │ │AAC-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│6 │Подтип IVa │4a1 │5'-TTT GAA TGC CCT CCA TGA │450 │

│ │ │ │ATA AAA T-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │4a2 │5'-AGA AAA GAT AGA AGT TCG │ │

│ │ │ │AAA GA-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│7 │Подтип IVb │4b1 │5'-AGT АСА TTT TAT CTT TGC │1000 │

│ │ │ │GTA-3' │ │

├───┼───────────┼────────┼────────────────────────────┼──────────┤

│ │ │4b2 │5'-AGT CAC TTC AAT ACG AGA │ │

│ │ │ │AAG TA-3' │ │

└───┴───────────┴────────┴────────────────────────────┴──────────┘

5.2.5.3. Идентификация генов, детерминирующих синтез

энтеротоксинов А (sea), В (seb), С (sec) и токсина синдрома

токсического шока (tst-H)

Для определения генов sea, seb, sec используется мультиплексная ПЦР.

Состав реакционной смеси стандартный. Концетрация праймеров для опредения генов sea - 15 пкм/мкл, seb, sec - 30 пкм/мкл.

Для определения гена tst-H концентрация MgCl в реакционной

2

смеси - 2,0 мМ, концентрация праймеров - 12 пкм/мкл.

Режим амплификации N 1

Таблица 3

НАБОРЫ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ SEA, SEB, SEC

Ген	Праймер	Олигонуклеотидная последовательность (5' - 3')	Локализация внутри гена	Размер ампли- фицированного продукта
sea	GSEAR-1	GGTTATCAATGTTGCGGGTGG	349 - 368	102
	GSEAR-2	CGGCACTTTTTTCTCTTCGG	431 - 450
seb	GSEBR-1	GTATGGTGGTGTAACTGAGC	666 - 685	164
	GSEBR-2	CCAAATAGTGACGAGTTAGG	810 - 829
sec	GSECR-1	AGATGAAGTAGTTGATGTGTAT	432 - 455	451
	GSECR-2	CACACTTTTAGAATCAACCG	863 - 882
tst-H	GTSSTR-1	ACCCCTGTTCCCTTATCAATC	88 - 107	326
	GTSSTR-2	TTTTCAGTATTTGTAACGCC	394 - 413