5.2.3. Вспомогательные методики

Выделение ДНК.

- 1,5 мл 18-час. культуры S. aureus, выращенной в жидкой питательной среде brain-heart-infusion или L-бульоне, осадить центрифугированием при 14000 об./мин. в течение 20 мин.;

- ресуспендировать в 500 мкл ТЕ буфера (рН 8);

- встряхнуть на Vortex;

- осадить центрифугированием при 14000 об./мин. в течение 5 мин.;

- буфер слить, оставив около 50 мкл, и снова встряхнуть на Vortex;

- добавить 100 мкл 6 М раствора гуанидина тиоцианата, встряхнуть на Vortex и инкубировать в ультратермостате при 65 °С в течение 20 мин., периодически встряхивая;

- осадить на Vortex в течение 30 сек.;

- добавить 20 мкл взвеси SiO ;

2

- встряхнуть на Vortex и снова инкубировать в ультратермостате при 65 °С 10 мин., продолжая периодически встряхивать на Vortex;

- осадить на Vortex 30 сек.;

- добавить 300 мкл 70% этанола;

- встряхнуть на Vortex;

- осадить на центрифуге Eppendorf при 5000 об./мин. в течение 1 мин., надосадочную жидкость отсосать пипеткой, меняя наконечники для каждой из проб;

- добавить 500 мкл этанола и встряхнуть на Vortex;

- центрифугировать при 5000 об./ мин. в течение 1 мин.;

- этанол отсосать пипеткой и снова осадить при 5000 об./мин., остатки этанола снова отсосать, пробы не сушить;

- к осадку добавить 100 мкл ТЕ буфера, встряхнуть на Vortex, инкубировать в ультратермостате 5 мин. при 65 °С;

- осадок удалить центрифугированием при 12000 об./мин. в течение 2 мин.;

- раствор ДНК сохранять при -20 °С (может храниться в течение нескольких лет).

Амплификация геномной ДНК

Амплификацию геномной ДНК проводят в 25 мкл реакционной

смеси. В состав стандартной реакционной смеси входят:

амплификационный буфер 2,5 мкл (10х) рН 8,6, 2,5 мМ каждого

трифосфата, 2,5 мМ MgCl , 0,4 мкл Tag-полимеразы (5 ед./мкл),

2

по 1 мкл каждогопраймера, 1 мкл ДНК-матрицы, деионизированную

воду добавляют до конечного объема 25 мкл. Концентрация праймеров

и количество MgCl может меняться в зависимости от свойств

2

праймеров. В ряде случаев концентрацию ДНК-матрицы следует

уменьшить путем разведения в 10 - 100 раз, используя

деионизированную воду.

Состав стандартной реакционной смеси, рассчитанный на различный объем проводимых исследований, представлен в таблице (Приложение, табл. 2).X

Техника постановки эксперимента:

- стерильные пробирки типа Eppendorf на 0,5 мл поместить в штатив и подписать;

- в одной из пробирок сформировать реакционную смесь, последовательно добавляя компоненты;

- разнести реакционную смесь по соответствующим пробиркам;

- внести в пробирки геномную ДНК и тщательно пипетировать, перемешивая пробы;

- поверх реакционной смеси наслоить несколько капель минерального масла (около 17 мкл);

- для удаления пузырьков воздуха пробирки центрифугировать в течение нескольких секунд в настольной центрифуге и перенести пробы в штатив амплификатора ДНК;

- установить и запустить необходимую программу амплификации ДНК.

Электрофорез в агарозном геле и визуализация продуктов амплификации

- Для приготовления 2,5%-ной агарозы необходимо к 1,25 г агарозы добавить Трис-ацетатный буфер до 50 мл и тщательно перемешать.

- Колбу с агарозой поместить в микроволновую печь и растопить агарозу, доводя несколько раз до непродолжительного кипения и перемешивая в промежутках между нагреванием.

- Расплавленную агарозу охладить до 50 °С, добавить 5 мкл раствора бромида этидия и залить в подготовленную форму для геля, избегая образования пузырьков в геле; толщина геля должна быть 0,5 - 0,7 см.

- Через 20 - 30 мин., когда гель сформируется, удалить гребенку и перенести его в камеру для электрофореза. В камеру залить Трис-ацетатный буфер так, чтобы он покрывал гель на 1 - 2 мм.

- Реакционную смесь, содержащую продукты амплификации ДНК, тщательно перемешать пипетированием и нанести в лунки агарозного геля. В крайнюю лунку нанести маркер молекулярной массы ДНК.

- Электрофорез проводят при 80 В (8,0 В/см), пока маркер не пройдет 4 - 4,5 см. Обычно электрофорез длится около 1,5 часов.

- Гель поместить на фильтр трансиллюминатора и просмотреть в проходящем ультрафиолете через защитный экран и специальные защитные очки. Фрагменты амплифицированной ДНК будут флюоресцировать под УФ оранжевым светом.

Рестрикционный анализ ДНК ПЦР-амплифицированного коагулазного гена

Постановка рестрикции

Рестрикцию проводить в объеме 15 мкл.

- 2 - 5 мкл ПЦР-продукта, содержащего около 500 ng ДНК, обработать 2 единицами рестриктазы Cfo1 согласно прилагаемой инструкции;

- реакционную смесь инкубировать в течение 2 час. при 37 °С в ультратермостате;

- 15 мкл полученного продукта анализировать путем электрофореза.