5. Лабораторные методы идентификации и типирования mrsa

Лабораторные методы можно подразделить на фено- и генотипические.

С помощью фенотипических методов изучаются характеристики, экспрессируемые микроорганизмами. Среди фенотипических методов для исследования MRSA используют определение антибиотико- и фагочувствительности. Генотипические методы представляют методы исследования структуры ДНК.

Основанием для проведения исследований служат данные клинического мониторинга за ВБИ, эпидемиологического мониторинга за уровнем ВБИ, вызванных S. aureus, так и данные микробиологического мониторинга, отражающие антибиотикочувствительность клинических изолятов.

5.1. Фенотипические методы

Определение чувствительности к оксациллину

Согласно Методическим указаниям 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам" идентификация MRSA проводится:

А) дискодиффузионным методом с использованием дисков, содержащих 1 мкг/мл оксациллина;

Б) с помощью скрининг-теста на агаре Мюллера-Хинтона, содержащего 4% NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина.

Следует учитывать, что оба метода имеют свои недостатки. В первом случае к категории метициллинрезистентных штаммов могут быть ошибочно отнесены клинические изоляты с гиперпродукцией бета-лактамазы, т.е. стафилококки с пограничным уровнем резистентности (borderline oxacillin-resistant S. aureus - BORSA, МПК оксациллина для которых колеблется в пределах 1,0 - 2,0 мкг/мл). Во втором - возникают трудности при идентификации MRSA, относящихся к первому классу по фенотипу гетерорезистентности. Ошибки при выявлении MRSA могут приводить как к неправильной тактике лечения пациентов, так и неверной оценке тяжести эпидемиологической ситуации.

Идентификация метициллинрезистентности возможна также путем определения продукции ПСБ-2' методом латекс-агглютинации с помощью готовых тест-систем, разрешенных к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке согласно инструкции производителя. В случае получения сомнительных результатов при использовании и этого метода необходимо прямое определение гена mecA, используя полимеразную цепную реакцию, являющуюся "золотым стандартом" для идентификации MRSA.

Идентифицированные как MRSA клинические изоляты в дальнейшем подлежат типированию с целью выявления источника(ов) инфекции в стационаре.

Фаготипирование

Более 40 лет фаготипирование было основным методом внутривидовой дифференциации S. aureus. Однако низкая чувствительность штаммов MRSA к бактериофагам Международного набора послужила толчком к бурному развитию молекулярно-генетических методов их типирования. В настоящее время фаготипирование следует рассматривать как вспомогательный метод, а результаты, полученные с его помощью, оценивать как предварительные, позволяющие выявить фенотипическое разнообразие исследуемых клинических изолятов MRSA.

Фаготипирование проводят с использованием Международного набора бактериофагов, выпускаемых ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, согласно прилагаемой стандартной методике. Для типирования необходимо использовать разведение фагов в концентрации 100 РТД, поскольку до 90% клинических изолятов MRSA нечувствительны к бактериофагам в концентрации 1 ТР.

При оценке результатов фагочувствительности следует иметь в виду, что клинические изоляты, чувствительные только к одному бактериофагу, принадлежат и к одному генотипическому варианту. Изоляты, чувствительные к нескольким одинаковым бактериофагам, могут принадлежать к различным генотипическим вариантам.

Согласно международным критериям при использовании типирующих бактериофагов в концентрации 1ТР изоляты, отличающиеся по чувствительности к бактериофагам на две сильные реакции, считаются различными. Однако, при использовании бактериофагов в концентрации 100ТР, такие изоляты, в ряде случаев, могут принадлежать к одному генотипическому варианту. В этой связи результаты фаготипирования следует рассматривать как ориентировочные, подлежащие дальнейшему подтверждению с помощью молекулярно-генетических методов типирования.

5.2. Молекулярно-генетический анализ генома MRSA

с использованием полимеразной цепной реакции

5.2.1. Обоснование

В настоящее время методы молекулярной биологии, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), находят все более широкое применение в целях диагностики и экспресс-анализа разнообразного биологического материала. Интенсивное развитие подобных методик обусловлено очень высокой чувствительностью ПЦР, возможностью быстрого получения результатов, низкой стоимостью получаемых результатов (по сравнению с другими методиками) и технологичностью. Другие молекулярно-биологические методы не только требуют для своей реализации сложного дорогостоящего оборудования, специально подготовленного персонала, но и специального программного обеспечения для обработки полученных результатов.

Проведенными в последние годы исследованиями установлено, что хромосома S.aureus составлена из двух категорий ДНК: хромосомного "ядра", полученного от бактерии-предшественницы, тесно связанной с представителями рода Bacillus, и "геномных островов", полученных от других бактерий в результате горизонтального переноса (33, 43).X

В связи с этим схема типирования MRSA, основанная на использовании метода ПЦР, включает исследование:

- структурного полиморфизма гена, входящего в состав хромосомного "ядра";

- генов и генных комплексов, находящихся на мобильных генетических элементах в составе хромосомы S.aureus.

Среди генов хромосомного "ядра", обладающих выраженным структурным полиморфизмом, в методику анализа включен ген, детерминирующий синтез коагулазы. На основании размеров образовавшихся ампликонов, а также размеров и числа рестрикционных фрагментов, полученных в результате обработки эндонуклеазой Cfol, исследуется фрагмент гена, расположенный между 1513 и 2188 нуклеотидами. Проведенный таким образом анализ позволяет выявить различные генотипические варианты S.aureus.

Среди генов, расположенных на мобильных генетических элементах, принципиально важным для дифференциации штаммов MRSA является исследование генных комплексов, входящих в состав стафилококковых хромосомных кассет mec, а также определение генов, детерминирующих синтез энтеротоксинов А, В, С и токсина синдрома токсического шока. Исследование структурного полиморфизма mec ДНК позволяет выявить клоны MRSA, отличающиеся содержанием разных типов SCCmec. Определение наличия генов PTSAgs позволяет выявить патогенный потенциал и охарактеризовать отдельные штаммы MRSA.

Схема анализа генома MRSA представлена на рис. 3.

┌───────────┐ ┌─────────────┐

│Определение│ │Идентификация│

┌─────────>│ наличия ├─────────>│ MRSA │

│ │ гена mecA │ └─────────────┘

│ └───────────┘

│ ┌───────────────────┐

┌──────────────┐ │ │ Исследование │

│ Образец ДНК │ │ │ гена, входящего в │

│ исследуемого ├─┴─┬──>│состав хромосомного├────┐

│ изолята │ │ │ "бэкграунда" │ │

└──────────────┘ │ └───────────────────┘ │

│ ┌──────────────────┐ │

│ │ Исследование │ │ ┌────────────┐

│ │генов, входящих в │ │ │Молекулярно-│

└──>│ состав мобильных ├─────┴──>│генетическое│

│ генетических │ │типирование │

│ элементов │ │MRSA │

└──────────────────┘ └────────────┘

Рис. 3. Анализ генома MRSA (схема)

Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное

копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени.

Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной

ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов

(дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК,

называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым

последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы

таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В

результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий

n

специфического фрагмента по формуле 2 , где n - число циклов

амплификации. Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из

которых соответствует определенный температурный режим.

1). Расплетение двойной спирали ДНК (денатуризация ДНК) происходит при 93 - 95 °С.

2). Присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре, специфичной для данной пары праймеров.

3). Синтез новых цепей ДНК протекает при 72 °С путем удлинения, начиная с праймера, в направлении 5' - 3'. В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется необходимое число копий фрагмента, которое делает возможным визуальный учет результатов после электорофореза в агарозном геле.

5.2.2. Оборудование и реактивы

Для идентификации и типирования MRSA используется стандартное оборудование ПЦР-лаборатории.

Оборудование и принадлежности

Настольная центрифуга типа Eppendorf для микропробирок объемом 1,5 и 0,5 мл

Ультратермостат для микропробирок

Встряхиватель для микропробирок типа Vortex

СВЧ-печь

Программируемый термостат (ДНК-амплификатор)

Электрофоретическое оборудование для разделения фрагментов ДНК в агарозном геле: источник напряжения для электрофореза и прибор для горизонтального миниэлектрофореза (миникамера)

УФ осветитель для визуализации результатов электрофореза (трансиллюминатор)

Гель-документирующая видеосистема

Термостат

Холодильник

рН-метр

Весы до 0,5 кг

Автоматические микропипетки переменного объема (0,5 - 10 мкл, 5 - 40 мкл, 200 - 1000 мкл)

Наконечники для микропипеток

Микроцентрифужные пробирки типа Eppendorf на 1,5 и 0,5 мл (свободные от ДНК-аз и РНК-аз)

Реактивы и растворы

Реактивы

tris(hydroxymethyl)aminomethane

НСl конц.

Ледяная уксусная кислота

ЭДТА

NaCl

Гуанидин тиоцианат

Этиловый спирт 95%

Агароза для электрофореза

Бромистый этидий

Бромфеноловый синий

Глицерин

Маркер молекулярной массы ДНК

Рестриктаза Cfo 1

Приготовление основных растворов

1 М Трис рН 8,0. Растворить 12,1 г Трис в 80,0 мл горячей дистиллированной воды. Для ускорения растворения мешать на магнитной мешалке с подогревом. Раствор довести до необходимого значения рН добавлением концентрированной HCl. Перед окончательным доведением рН дать раствору остыть до комнатной температуры и довести объем до 100 мл.

0,5 М ЭДТА рН 8,0. Добавить 18,6 г двузамещенной соли ЭДТА х 2

Н О к 80,0 мл воды. Интенсивно размешать на магнитной мешалке.

2

Довести рН до 8,0 с помощью NaOH (около 2,0 г NaOH).

70%-ный этанол. Для приготовления 100 мл раствора требуется 74 мл 95% этанола и 26 мл воды.

Взвесь SiO . К 10 мл дистиллированной воды добавить 0,1 мл

2

1 М HCl и 2 г SiO .

2

6 М раствор гуанидина тиоцианата. К 21,3 г гуанидина тиоцианата добавить небольшое количество дистиллированной воды (5 - 7 мл), подогреть на водяной бане до почти полного растворения гуанидина и довести объем до 30 мл.

Трис-ацетатный (ТАЕ) буфер для электрофореза (0,04 М Трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА). Для приготовления 0,5 л концентрированного (50х) буфера 121 г Трис растворить в 300 мл горячей воды (Трис растворяется медленно, в течение приблизительно 20 мин., лучше перемешивать на магнитной мешалке с подогревом), добавить 50 мл 0,5 М раствора ЭДТА и около 25 мл ледяной уксусной кислоты, перемешать на магнитной мешалке, довести рН до 8.

ТЕ буфер. К 1 мл 1 М Трис-HCl рН 8,0 добавить 1 мл 0,5 М

раствора ЭДТА рН 8,0 и 98 мл дистиллированной Н О.

2

Буфер для нанесения образца - 6х (0,25%-ный бромфеноловый синий, 30%-ный глицерин, 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА). Для приготовления 10 мл буфера для нанесения требуется: к 9,9 мл 30% водного раствора глицерина добавить 2,5 мг бромфенолового синего, 0,1 мл Трис, 0,02 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0.

Раствор этидия бромида (10 мг/мл). Растворить 0,1 г этидия бромида в 10,0 мл воды. Для визуализации ДНК в агарозном геле используется раствор в концентрации 5 мкг/мл. Внимание! Все манипуляции с бромидом этидия и его растворами проводить в перчатках.

Все приготовленные растворы можно хранить при 4 - 12 °С в течение 2-х лет.