Лабораторна робота № 1 кольорові реакції на білки

Мета роботи: вивчення кольорових реакцій, які підтверджують наявність у білковій молекулі пептидного зв’язку, залишків ароматичних амінокислот, триптофану, сульфурвмісних амінокислот, аргініну, гістидину і тирозину.

Кольорові реакції на білки обумовлені наявністю в молекулі білка тієї чи іншої амінокислоти або утвореного ними хімічного угрупування. Тому кольорові реакції на білки використовують для доказу білкової природи речовини, визначення якісного та кількісного амінокислотного складу різноманітних природних білків.

Дослід 1. Біуретова реакція (реакція Піотровського).

Якщо додати у лужний розчин білка розчин Купрум (ІІ) сульфату, рідина набуває фіолетового забарвлення. Реакція зумовлена наявністю в молекулі білка пептидних зв’язків –СО-NH-, які при взаємодії з іонами Купруму утворюють забарвлені комплексні сполуки.

Реакція перебігає за наступною схемою:

Хід роботи

В пробірку наливають 1 мл розведеного яєчного білка, 1 мл 10%-го розчину Натрій гідроксиду та 1-2 краплини 1%-го розчину Купрум (ІІ) сульфату. Під час перемішування з’являється фіолетове забарвлення.

Дослід 2. Ксантопротеїнова реакція.

Більшість білків під час нагрівання з концентрованою нітратною кислотою дають жовте забарвлення, яке при додаванні розчину лугу або амоніаку переходить в помаранчеве. Ця реакція характерна для ароматичного ядра циклічних амінокислот (фенілаланіну, тирозину і триптофану), які містяться майже у всіх білках. Під час дії концентрованою нітратною кислотою на ці амінокислоти відбувається нітрування їх ароматичного ядра з утворенням нітросполук жовтого кольору, які під час додавання лугу перетворюються в солі хіноїдної структури, забарвлені в помаранчевий колір.

Аналогічно перебігає реакція нітрування фенілаланіну та триптофану.

Ксантопротеїнова реакція спостерігається на шкірі, нігтях, вовні, якщо попасти на них концентрованою нітратною кислотою (жовте забарвлення).

Білки, у складі яких циклічні амінокислоти відсутні, не дають ксантпротеїнової реакції. До таких білків відносяться желатин, сальмін тощо.

Хід роботи

В пробірку наливають 5 крапель яєчного білка, додають 2-3 краплі концентрованої нітратної кислоти і нагрівають. Поступово з’являється лимонно-жовте забарвлення. Після охолоджування і додавання 5-10 крапель 30%-го розчину NaOH з’являється помаранчеве забарвлення.

Дослід 3. Реакція Адамкевича на триптофан.

Амінокислота триптофан, реагуючи з гліоксалевою кислотою, завжди присутньою у вигляді домішки у концентрованій оцтовій кислоті, утворює червоно-фіолетові продукти конденсації.

Інтенсивність здобутого забарвлення залежить від кількості триптофану в білку. Вміст триптофану в яєчному та соєвому білках в два рази більший, ніж у пшеничному. В желатині триптофан відсутній.

Хід роботи

У пробірку наливають 5 крапель яєчного білка, додають 5 крапель концентрованої оцтової кислоти, трохи нагрівають, потім обережно підшаровують однаковим обсягом концентрованої сульфатної кислоти. На межі двох шарів рідини з’являється червоно-фіолетове кільце. Концентрована сульфатна кислота вживається як водовіднімаючий засіб.

Дослід 4. Реакція Фоля на сульфурвмісні амінокислоти.

Під час кіп’ятіння амінокислот цистеїну та цистину в лужному середовищі від них легко відщеплюється сірка у вигляді Гідроген сульфіду, який у лужному середовищі утворює Натрій сульфід. Натрій сульфід при взаємодії з Плюмбум ацетатом утворює бурий або чорний осад Плюмбум сульфіду.

Na₂S + Pb(CH₃COO)₂ → PbS↓ + 2CH₃COONa

_{чорний осад}

Інтенсивність забарвлення залежить від кількості сульфурвмісних амінокислот у складі білка та від концентрації білка у розчині.

Желатин майже не містить сульфурвмісних амінокислот і тому не дає реакцію Фоля.

Хід роботи

У пробірку вносять 5 крапель розчину яєчного білка, 5 крапель 30%-го розчину Натрій гідроксиду, 1 краплю розчину Плюмбум ацетатуі нагрівають до появи чорного осаду Плюмбум сульфіду.

Дослід 5. Реакція Сакагучі на аргінін.

Гуанідинові угрупування радикалів аргініну, що міститься в молекулі білка, у присутності окисника взаємодіють з α-нафтолом, внаслідок чого з’являється оранжево-червоне забарвлення. Реакція перебігає за наступною схемою.

ОН

2 H₂N CNH(CH₂)₃ CH COOH + 3NaClO + 2 

 

NH NH₂

а ргінін -нафтол

2 O = =N-CNH(CH₂)₃CHCOOH + 3NaCl + 3H₂O



NH NH₂

нафтохінонімін (оранжево-червоного кольору)

Хід роботи

У пробірку вносять 2-3 мл розчину яєчного білка, додають 1 мл 10%-го розчину Натрій гідроксиду і слідом за цим декілька крапель 0,2%-го розчину α-нафтолу. Перемішують, доливають 0,5 мл Натрій гіпохлориту і знову перемішують до появи оранжево-червоного забарвлення.

Дослід 6. Реакція Паулі на гістидин і тирозин.

При взаємодії кислого розчину сульфанілової кислоти з Натрій нітритом здійснюється реакція діазотування з утворенням діазобензенсульфонової кислоти, яка, в свою чергу, при взаємодії з радикалами гістидину і тирозину утворює сполуку вишнево-червоного кольору.

Хід роботи

У пробірку наливають 1 мл 1%-го розчину сульфанілової кислоти в 5%-му розчині хлороводневої кислоти, додають 2 мл 0,5%-го розчину Натрій нітриту, сильно струшують і негайно додають спочатку 2 мл розчину яєчного білка, а потім, після перемішування вмісту пробірки, 6 мл 10%-го розчину Натрій карбонату. Після змішування розчинів з’являється вишнево-червоне забарвлення.

Результати лабораторної роботи слід записати у вигляді таблиці 1.1.

Таблиця 1.1.

№	Назва реакції	Реактиви, що використовуються	Забарвлення, що спостерігається	Пояснення реакції

Завдання для самостійної роботи: вивчити теоретичний матеріал за темою, підготувати відповіді на контрольні питання.