6. Использование хроматографии на бумаге для количественного определения сахаров в растительном материале

В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивидуальных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. Существует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичественный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение максимальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи счетчика Гейгера — Мюллера.

Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества.

Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%.

7. Газожидкостная хроматография триметилсилильных производных сахаров

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных углеводов представляет собой хорошо отработанный метод, который в течение ряда лет используется для анализа сложных смесей сахаров, таких, как кукурузная патока или в общем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров.

Этот метод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увеличивает устойчивость триметилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой избыток реагента. Поэтому стандартная калибровочная смесь устойчива в течение нескольких месяцев, что весьма важно для хранения контрольных образцов редких олигосахаридов.

8. Газожидкостная хроматография метилированных сахаров

Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют.

Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов.

Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущих детекторам, или следствием потерь некоторых компонентов при подготовке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Твердые правила выбора колонки еще не выработаны. Тем не менее изучение литературных данных показывает, что большинство исследователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, дают лучшее разрешение всех типов производных метилированных сахаров. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избежать расхождений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до ±2%, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до ±5%.

Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70—90 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа.