22. Бактериофаги.

Бактериофаги Вирусы, поражающие прокариоты, называются фагами. В 1898 г. русский ученый Н.Ф. Гамалея при изучении сибирской язвы крупного рогатого скота заметил, что возбудители болезни растворялись под воздействием какого-то агента. В 1915 г. подобный феномен наблюдал английский бактериолог Ф. Туорт (при длительном выращивании на питательной среде стафилококков происходило их растворение). В 1917 г. канадский микробиолог Ф.ДۥЭрелль наблюдал лизис бактериальной культуры дизентерии под влиянием фильтрата испражнений больных людей. Агента, растворяющего бактерии, ДۥЭрелль назвал бактериофагом, т.е. "пожирателем бактерий" (греч. bacterium – бактерия, phagos – пожирающий). ДۥЭрелль высказал предположение, что открытый бактериофаг представляет собой вирус бактерий, который размножается внутри бактериальной клетки, вследствие чего она лизируется и в окружающую среду выходят частички вновь образовавшегося вирусного потомства. Структура и химический состав фагаБольшинство фагов имеют сперматозойдную форму. Фаги состоят из головки, содержащей НК, и отростка. Размеры фаговой частицы 20-200 нм. средний размер головки 60-100 нм, длина отростка 100-200 нм. Многогранная головка покрыта снаружи белковой оболочкой. Отросток представляет собой стержень, покрытый чехлом. Имеются также базальная пластинка, зубцы, нити. Выявлены и другие морфологические группы фагов (с длинными, короткими отростками, без отростка, нитевидные)Фаг состоит из НК (40%) и белка (60%). Большинство фагов содержат ДНК, лишь некоторые – РНК. ДНК в основном двунитчатая, реже однонитчатая, РНК однонитчатая. В составе ДНК некоторых фагов обнаружены необычные азотистые основания. Фаги специфичны в отношении хозяина – определенный фаг поражает только один штамм или ограниченное число родственных штаммов или видов. И в то же время один вид бактерий может поражаться различными вирусами (например, у кишечной палочки десятки фагов).Резистентность. Фаги выдерживают давление до 6000 атм., устойчивы к действию радиации, сохраняют активность при рН от 2,5 до 8,5, хорошо переносят замораживание и высушивание. Однако они быстро погибают при кипячении, действии кислот, ультрафиолетовых лучей, химических дезинфицирующих веществ.

Распространение и использование фагов. Бактериофаги широко распространены в природе. Всюду, где размножаются бактерии, актиномицеты, микоплазмы, удается обнаружить и паразитирующие в них фаги. Фаги находятся в кишечнике человека и животных, в сточных водах, почве. Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике при идентификации микроорганизмов. Фаги служат удобной моделью для решения важнейших проблем молекулярной биологии, вследствие простоты культивирования, короткого периода генерации, высокого выхода потомства и возможности точного его количественного учета.Лизогения

Лизис бактерий фагом не единственный тип взаимодействия фага и бактерии. имеет место взаимодействие, при котором фаг не разрушает бактерию, а лизогенизирует ее, т.е. делает способной продуцировать фаги вследствие присутствия их в геноме интегрированной фаговой ДНК. Лизогенные бактерии представляют собой практически единственный пример здоровых клеток, сохраняющих в течение неопределенно долгого времени потенциальную способность продуцировать вирусы, т.е. в клетке вирус не вызывает никаких патологических изменений.

В лизогенных бактериях фаг находится в состоянии профага, и каждая лизогенная клетка несет один профаг. По характеру взаимодействия с бактериальной клеткой различают два типа бактериофагов – вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги в клетке находятся в состоянии вегетативного фага (способного к воспроизведению), вызывают лизис клетки, при котором освобождается большое количество фаговых частиц, в состоянии зрелого фага (находящегося вне клетки, метаболически инертного).

Умеренные фаги вызывают лизогенную реакцию: клетки не подвергаются лизису, а фаговая ДНК включается в ДНК клетки, приобретая форму профага, и реплицируется как часть бактериального генома. Умеренным фагам свойственны состояния зрелого фага, вегетативного фага и профага – неинфекционной структуры, которая способствует образованию инфекционного фага без вмешательства экзогенного фага.

Явление лизогении распространено повсеместно. Бактерии могут быть естественно лизогенными и искусственно лизогенными. Цитологически лизогенные бактерии не отличаются от нелизогенных. Лизогенным бактериям присущи иммунитет к гомологическому фагу и индукция фагов, когда профаг переходит в состояние вегетативного фага (реплицируется в клетке и лизирует ее).

23. Рекомбинации у бактерий Рекомбинация генов – процесс образования смешанного потомства в результате генетического обмена между двумя клетками. Вследствие рекомбинации образуются новые бактериальные клетки (рекомбинанты) с признаками обеих клеток. Рекомбинанты содержат основной набор генов реципиента и определенную часть клеток донора. У бактерий к образованию рекомбинантных хромосом ведет три способа переноса генетической информации: трансформация, конъюгация, трансдукция.

Трансформация (лат. transformation – преобразование, превращение) – это изменение свойств бактериальной клетки в результате переноса информации, при котором фрагмент ДНК клетки-донора проникает в клетку – реципиент родственного штамма или вида. Впервые явление трансформации у бактерий наблюдал Ф.Гриффитс в 1928 г. В 1944 г. О.Эвери , К.Мак-Леод и М.Мак-Карти экспериментально доказали, что трансформирующим веществом является ДНК.

Не все клетки бактерий способны воспринимать ДНК. Клетки, которые воспринимают трансформирующую ДНК, называются компетентными. Они синтезируют специфический белок. Существуют и другие факторы компетентности. Количество компетентных клеток в бактериальной популяции составляет в среднем 1-2%. Состояние компетентности связано со стадией активного размножения бактерий и появляется в начале логарифмической фазы. Продолжительность этого состояния в среднем составляет 15 мин. Процесс трансформации происходит в несколько стадий: 1) адсорбция и восприятие бактериями-реципиентами фрагмента двунитчатой ДНК клетки-донора (обычно не более 5 генов); 2) эклипс – скрытый период, характеризующийся отсутствием биологического действия ДНК.В этот период двунитчатая ДНК распадается: одна цепь разрушается, другая – участвует в последующих стадиях; 3) интеграция (включение) трансформирующей ДНК в хромосому реципиента в результате разрыва и воссоединения хромосомы донора; 4) экспрессия (проявление генов), т.е. размножение трансформированного клона клеток, потомство которых будет иметь измененный ген. Таким образом, при трансформации происходит замещение одного генетического участка другим. При этом процессе происходит трансформация чаще одного какого-нибудь признака, реже – двух, так как в реципиентную клетку проникает малый фрагмент ДНК. Различают гомотрансформацию – перенос генетической информации от одного штамма к другому в пределах одного вида, и гетеротрансформацию – перенос ДНК от одного вида к другому.

Конъюгация (лат. conjudatio – сопряжение, совокупление) – передача генетического материала из клетки в клетку при непосредственном контакте путем образования цитоплазматического мостика между бактериями. Явление конъюгации впервые описали в 1946 г. Дж.Ледерберг и Э.Татум. Способность бактериальной клетки конъюгировать связана с наличием в ней полового фактора F (англ. fertility – плодовитость) – внехромосомой автономной детерминанты (F-плазмиды). Доноры содержат половой фактор (F+ ), реципиенты – не содержат (F-). Доноры способны синтезировать дополнительные поверхностные структуры – F-пили. Эти поверхностные структуры имеют форму ворсинок. Количество F-пилей от 3 до 10 соответствует числу копий полового фактора. Половые ворсинки представляют собой полые цилиндрические отростки толщиной 8-35 нм, длиной 1-2 мкм, образованные белком пилином. Формируются F-пили только у активно растущей клетки за 4-5 мин и в течение такого же промежутка времени сохраняются на ее поверхности, затем сбрасываются. Процесс конъюгации начинается с прикрепления клетки-реципиента к кончику F-пиля, затем клетки приближаются друг к другу. Образуется конъюгационный цитоплазматический мостик, через который и происходит передача донорского генетического материала. Конъюгация бывает внутривидовая (между штаммами одного вида), межвидовая, межродовая.

Трансдукция – это перенос генетического материала от одних бактериальных клеток к другим с помощью фага. Трансдуцирующий фаг переносит фрагмент ДНК от клетки донора к реципиенту и вводит эту ДНК таким же образом, как и свою собственную ДНК.

Общая (неспецифическая, генерализованная, множественная) трансдукция - перенос любого гена или одновременно нескольких генов. Трандуцирующий фаг выступает в качестве "пассивного" переносчика генетического материала бактерии, захватывая фрагмент бактериальной ДНК место своего генома. Включения фаговой ДНК в бактериальную хромосому не происходит. Такие трансдуцирующие фаги получили название дефектных фагов. Специфическая (ограниченная) трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены. При взаимодействии таких фагов с клетками реципиента происходит включение гена клетки донора в хромосому реципиента вместе с ДНК дефектного фага, т.е. происходит лизогенизация бактерий-реципиентов. Бактерии, лизогенизированные дефектным фагом, невосприимчивы к последующему заражению тем же вирулентным фагом. Вместе с тем эти бактерии не способны в обычных условиях образовывать зрелый фаг. Абортивная трансдукция – перенесенный фагом фрагмент хромосомы донора на включается в хромосому клетки-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления клетки трансдуцированный фрагмент ДНК донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследуется однолинейно и в конечном итоге утрачивается в потомстве.

Таким образом, все три процесса генетической рекомбинации у бактерий заключаются в переносе фрагмента ДЕК от одной клетки к другой. При трансформации в бактерию-реципиент входит свободная ДНК; в процессе конъюгации происходит перенос фрагмента ДНК при образовании цитоплазматического мостика между бактериями; при трансдукции фаг захватывает участок хромосомы бактерии-донора и передает реципиенту; причем, при всех трех процессах переносится не вся хромосома, а ее фрагмент.

24. Мутации Мутации (лат. mutation – перемена, изменение) – внезапные стойкие наследственные изменения, возникающие в результате нарушения последовательности одной или более пар азотистых оснований в молекуле ДНК и приводящие к появлению новых признаков.

По происхождению различают спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в любой популяции бактерий без видимого внешнего воздействия. Они служат основным источником естественной изменчивости бактерий и лежат в основе их эволюции. Индуцированные мутации могут возникать под воздействием определенного мутагенного фактора. Мутагенные факторы могут быть биологической, химической и физической природы, например, вирусы бактерий, перемещающиеся генетические элементы, азотистая кислота, нитрозосоединения, акридиновые красители, ионизирующее и ультрафиолетовое излучения. По проявлению изменяющихся признаков различают мутации морфологические, физиологические, биохимические. Морфологические мутации сопровождаются утратой морфологических элементов (жгутиков, капсулы, клеточной стенки). Биохимические мутанты подразделяются на ауксотрофные и ферментативные. Ауксотрофные бактерии – это клетки, потерявшие способность самостоятельно синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины и другие факторы роста; ферментативные мутанты частично или полностью дефектные по одному или нескольким метаболизирующим ферментам и поэтому дефектные к восприятию субстрата.

По количеству мутировавших генов и характеру изменений в первичной структуре ДНК различают генные и хромосомные мутации. Генные мутации затрагивают только один ген. Они чаще всего являются точковыми и представляют собой выпадение, вставку или замену пары оснований. Замены оснований могут приводить к изменению смысла генетической информации (миссенс-мутации), когда вместо одной аминокислоты кодируется другая, к образованию бессмысленных кодов (нонсенс-мутации), которые не несут информации о синтезе какой-либо аминокислоты. Хромосомные мутации распространяются на несколько генов. Эти мутации возникают в результате выпадения участка хромосомы (делеция), либо поворота участка ДНК на 180⁰ (инверсия), либо повторения какого-нибудь фрагмента ДНК (дупликация).

Диссоциация (лат. dissociation – разделение) – это разделение однородной популяции бактерий по культуральным свойствам на типы, отличающиеся от исходной популяции внешним видом и структурой колоний, а также стойкими изменениями некоторых биологических признаков. Эти изменения не затрагивают основные таксономические признаки вида. Таким образом, диссоциация – внутривидовая изменчивость. Она может возникать спонтанно и может быть вызвана искусственно.