5. Матеріали та методи досліджень

5.1 Об’єкти досліджень

У роботi використовувались: штам дріжджів із музею Інституту біології клітини: трансформант Tf 11-6 H. polymorpha NCYC 495 (leu 1-1) – над-продуцент ФдДГ; препарат фермента АО (12 од хв^-1мг^-1 білку) із дріжджового штама над-продуцента H. polymorpha К-105; сорбенти: діасорб А, гепарин–G силохром, гепарин–Е силохром, діасорб-ПЕІ, граміцидин С-силохром, бацитрацин-силохром.

Клітини штаму Tf 11-6 та препарат АО були люб’язно надані для досліджень співробітниками відділу аналітичної біотехнології ІБК НАН України інженером Демків О.М. і м.н.с. к.б.н. Павлішко Г.М., відповідно.

5.2. Одержання безклітинного екстракту.

До осаду клітин Tf 11-6 додавали 50 мМ К,Nа-фосфатний буфер, рН 7,5 з 1-2 мМ ЕДТА до кiнцевої концентрацiї клiтин 50-100 мг/мл. Одержану суспензiю розливали в стаканчики для гомогенiзацiї, вносили склянi кульки (дiаметр 0,45-0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на планетарному гомогенiзаторi протягом 5 хв при 1000 об./хв при + 4⁰С. Для отримання екстракту гомогенат центрифугували протягом 30 хв при 13000 об./хв при + 5 ⁰С на центрифузі ЦР-21. Для досліджень відбирали супернатант.

5.3. Визначення активностi алкогольоксидази

Питому активність ферменту виражали в мкмоль субстрату (продукту), витраченого (утвореного) за 1 хв в перерахунку на 1 мг білка або сухої маси клітин за стандартних умов реакції (мкмольхв^-1мг^-1).

Склад реакційної суміші (на 10 аналізів):

0, 3 мМ о-діанізидин 25,0 мл

Пероксидаза, мг/мл 2,0 мл

У пробірки розливали по 2,7 мл реакційної суміші. У дослідні проби вносили по 0,015-0,15 мл препарату АО (крім сліпої проби, у яку вносили 0,15 мл води). Проби інкубували 5 – 10 хв при 30 ^oС на водяній бані. Реакцію запускали 0,15 мл 0,2 М метанолом у строго фіксований час, яку проводили упродовж 5 – 10 хв, залежно від розвитку кольорової реакції. Реакцію зупиняли у точно фіксований час додаванням 0,8 мл концентрованої соляної кислоти. Вимірювання оптичної густини дослідних проб проводили при довжині хвилі 525 нм у 1 см – кварцевих кюветах об’ємом 4 мл проти сліпої проби.

Розрахунок питомої активності ферменту проводили за наступною формулою:

En

П.А. = (мкмольхв^-1мг^-1), де

13,38tС

E – оптична густина кінцевого фотометрованого розчину;

n – сумарне розведення досліджуваного зразка;

13,38 – коефіцієнт мілімолярной екстинкції, мМ^-1;

t – час ферментативної реакції, хв;

С – концентрація білка за Лоурі, мг/мл.

5.4. Визначення концентрації білка

Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі, який ґрунтується на утворенні забарвлених продуктів реакції ароматичних амінокислот з реактивом Фоліна у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв’язки. Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика.