6.4 Реконструкція аргінази в присутності іонів металів

Дослідження процесу реконструкції різних форм аргінази проводили наступним чином.

Для дослідження кінетики реконструкції нетегованої форми аргінази з активністю 40 Од./мл її преінкубували при 50 ºС в присутності іонів мангану чи кобальту різної концентрації (1 – 20 мкМ

12

чи 0,5 – 5 мкМ відповідно) протягом певного часу. Для визначення активності відбирали аліквоти преінкубованого розчину ферменту аргіназ без та з іонами металів через певні проміжки часу (рис.2, 3). Аналізуючи рисунки 2, 3 видно, що для реконструкції ферменту потрібна вища концентрація кобальту порівняно із манганом.

Рис. 2 Аналіз кінетики реконструкції нетегованої форми аргінази за різних концентрацій мангану.

Рис. 3 Аналіз кінетики реконструкції нетегованої форми аргінази за різних концентрацій кобальту.

Для дослідження кінетики реконструкції (His)₆-тегованої форми аргінази з активністю 826,67

13

Од./мл її преінкубували при 50 ºС в присутності іонів мангану різної концентрації (1 – 20 мкМ) протягом певного часу. Для визначення активності відбирали аліквоти преінкубованого розчину ферменту аргінази через певні проміжки часу (рис.4, А, В). Як видно з рисунку (рис.4, А. В), що реконструкція (His)₆-тегованої форми ферменту при низьких (0,1-1мкМ) концентраціях мангану в порівнянні з вищими (2-20 мкМ) проходить досить повільно.

Рис. 4 Аналіз кінетики реконструкції (His)₆-тегованої форми аргінази за різних концентрацій мангану.

Тому на наступному рисунку показано підбір концентрацій кобальту при, яких буде проходити реконструкція (His)₆-тегованої форми ферменту. І як бачимо з рисунку 5 реконструкція

14

ферменту проходить досить стрімко і у лінійній залежності про концентраціях вищих за 1 мкмоль.

Рис. 5 Реконструкції (His)₆-тегованої форми аргінази за різних концентрацій кобальту.

6.5 Спектральна характеристика аргінази

Проведення спектрального аналізу показали, що спектри нетегованої та (His)₆-тегованої форм аргіназ відрізняються між собою. Для нетегованої форми зміна спектру відбувається при 250 нм – 290 нм. Для (His)₆-тегованої форми аргінази спектральні зміни відбуваються при 225 нм – 300 нм.

15

Рис. 5 Спектри препаратів реконструйованих форм нетегованої (А) та (His)₆-тегованої (В) форм аргіназ І людини

7. Виконання додаткових завдань

Під час практики мною були виконанні додаткові завдання:

1. Виміри активності формальдегіддегідрогенази.

2. Проведення якісних реакцій на каталазу.

16

Висновки

1. Виділено препарат високоочищеної аргінази І печінки людини із рекомбінантного штаму метилотрофних дріжджів H. рolymorpha;

2. Отримано апофермент рекомбінантної форми аргінази;

3. Проведено кінетичні дослідження процесу реконструкції металоферменту.

17

ЛІТЕРАТУРА

1. Zamecka E.E., Morris S.M. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond // J. Biochemistry. – 2001. – Vol.3. – P.1-17.

2. Christianson D.W., Moulin M.L., Meiller F.D. Expression, purification, assay and crystal structure of prodeuterated human arginase I // J. Biochemistry. – 2007. – Vol.65. – P.82-89.

3. Gerge A.K., Venegas J.S. Isolation and characterization of Arginase from rabbit liver // J. Biochem. – 1973. – Vol.133,No.12. – P.779-788.

4. Швачко Л.П., Киберев В.К., Гайда А.В., Магеровский Ю.В., Монастырский В. А. Получение тромбина человека з помощью аффинной хроматографии на грамицидин С - силохроме С – 80 // Укр. биохим. ж. – 1988. – № 60. – С. 3 – 7.

5. Carvajal N, Torres C, Uribe E, Salas M. Interaction of arginase with metal ions: studies of the enzyme from human liver and comparison with other arginases // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.- 1995.- Vol.112(1) – P. 3-9.

6. Стасюк Н.Є., Гайда Г.З., Ковальчук Є. П. та ін. Аргіназа і людини із рекомбінантних дріжджів Hansenula polymorpha: виділення та характеристика ферменту // УБЖ - 2010. Т.82, № 6. – С. 14 – 21.

7. Mistry S.K., Morris S.M. Arginase I: a limiting factor for nitric oxide and polyamine synthesis by activated macrophages // J. Physiol. – 2000. – Vol.279. –P.2237-2242.

8. Morris S.M., Kepka-Lenhart D.Y. Human type arginase: sequence analysis and tissue – specific expression // J. Arch Biochem. Biophys. – 2007. – Vol.389. – P.135-143.

9. Wheatley D.N. Controlling cancer by restricting arginine availability – arginine catabilizing enzymes as anticancer agents. Anticancer Drugs // J. Clinical Oncology. – 2004. – Vol.15. – P.825-833.

18