6. Результати досліджень та їх обговорення
6.1. Виділення рекомбінантної аргінази людини
Розчин БЕ (з сумарною активністю 25·103 од.) наносили на колонку, заповнену афінним сорбентом аргінін-макропористе скло, проскок i промивні розчини відбирали і визначали концентрацію білка та активність аргінази. Фермент елюювали послідовно зростаючими концентраціями 0,1 М, 0,25 М, 1 М NaCI/30 мМ тріс-HCl, pH 8,5. Фракції по 2 мл збирали за допомогою колектора фракцій.
Таблиця1 Хактеристика хроматографічного очищення аргінази .
|
V, мл |
Сбілка, мг/мл |
∑білок, мг |
AЕ, Од./мл |
AЕ, Од./мг |
∑А, Од. |
Вихід (%) |
Очистка (раз) |
Безклітинний екстракт (БЕ) |
8 |
9,97 |
79,8 |
1890 |
189 |
15120 |
=100 |
1 |
Проскок + Промив,30 мМ тріс-HCl, pH 8,5 |
7,5 |
2,15 |
16,13 |
0,72 |
0,33 |
5,4 |
|
|
Промив 1: 0,1 М NaCI /30 мМ тріс-HCl, pH 8,5 |
5 |
0,21 |
1,05 |
16,5 |
78,6 |
82,5 |
|
|
Промив 2: 0,2 М NaCI /30 мМ тріс-HCl, pH 8,5
|
7 |
0,25 |
1,75 |
28,4 |
113,6 |
289,4 |
1,9 |
|
Елюція 1 М NaCI/ 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5 Фракції 1 |
1 |
1,63 |
1,63 |
23,6 |
14,5 |
23,6 |
|
|
2 |
1 |
1,42 |
1,42 |
52,2 |
36,8 |
52,2 |
|
|
3 |
1 |
0,067 |
0,067 |
41,0 |
624,1 |
41,0 |
|
|
4 |
1 |
0,024 |
0,024 |
37,4 |
1544,3 |
37,4 |
0,24 |
8,3 |
6.2 Електрофорез
Ступінь очищення цільового фермента від баластних білків характеризували, визначаючи його активність та концентрацію білка в кожній фракції елюату (таблиця 1) та за допомогою електрофорезу в ПААГ за Лемлі (Рис. 1).
11
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Рис. 1. Електрофоретична характеристика препаратів аргінази в 12% SDS-ПААГ в ході очистки:,безклітинний екстракт до нанесення на колонку (1); проскок з колонки (2); промив 0,1 М NaCl (3, 4); елюати 1 М NaCI в ХБ, фракції (5 – 10).
6.3 Отримання апоферменту рекомбінантних аргіназ, позбавлених металів.
Для отримання апоферменту використовували дві форми аргіназ, а саме одержану нами (п. 6.1-6.2) із початковою активністю при об’єднані фракцій 40 Од./мг та (His)6-теговану. Фермент (His)6-тегованої форми (з активністю 826,67 Од./мл) був люб’язно наданий к.б.н. Закальським А.Є., відділ аналітичної біотехнології.
Розчини, які ми використовували для отримання апоферментів, були очищені від залишків металів за допомогою сорбенту Chelex®. За схемою: 5 г сорбенту в 100 мл розчину перемішували протягом 3 годин на магнітній мішалці. Очищений розчин декантували.
При отриманні апоферментів препарати аргіназ діалізували послідовно:
5 год – проти 0,1 мМ ЕДТА у очищеному від металів 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5, 3 год – проти води; 16 год – проти 0,1 мМ ЕДТА у 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5, 3 год – проти води.