5.5 Визначення активності аргінази
Процедуру вимірювання активності проводили в два етапи:
Ферментативна реакція
10 мкл розчину аргінази змішували з 200 – 1000 мкл субстрату. Субстрат містив 13 мМ аргінін, 2 мМ манган (ІІ) хлорид в 20 мМ буфері трис-основа, рН 9,5. Суміш інкубували при 37 oС на водяній лазні протягом 15 хв., реакцію зупиняли додаванням 50%-го розчину ТХО до кінцевої концентрації 5%. Отриманий після центрифугування (14 000 g, 10 хв) супернатант використовували для визначення в ньому концентрації сечовини.
Кольорова реакція
8
Кількість утвореної в результаті ферментативної реакції сечовини визначали за кількістю забарвленого червоно-рожевого комплексу діацетилу із сечовиною, що має максимум поглинання при 520 нм.
Для визначення сечовини застосовували готові набори реактивів виробництва НВФ «СІМКО», Львів.
До 30 мкл кислого супернатанту, що одержано на стадії 1, додавали 1 мл реагенту № 2 і 2 мл реагенту № 1. Перемішували, інкубували 10 хв на кип’ячій водяній бані, потім швидко охолоджували в потоці холодної води і не пізніше, ніж через 10 хв визначали на СФ-46. в кюветі l=1 см, а оптичну густину при λ=520 нм навпроти контролю. Аналогічно обробляли 30 мкл стандарту сечовини і контроль – 30 мкл дистильованої води. Розрахунок вмісту сечовини проводили за формулою:
,
де Ссеч– концентрація сечовини, мМ;
Dдосл – поглинання дослідної проби, нм;
Dст – поглинання стандартного розчину, нм;
16,65 – концентрація сечовини в стандартному розчині.
5.6 Електрофорез
Електрофорез проводили у вертикальних пластинах, використовуючи SDS- трис-гліциновий електрофоретичний буфер (за Laemmly), pH 8,3, при кімнатній температурі, 1,5 – 2 год в SDS-поліакриламідному гелі (ПААГ), що складався з:
а) 3 мл 5% концентруючого гелю:
Н2О 3,4 мл;
30% суміш акриламіду/метиленбісакриламіду 0,83 мл;
1,0 М тріс-гліциновий буфер (рН 6,8) 0,63 мл;
10% амоній персульфат 0,05 мл;
10% SDS 0,06 мл:
ТЕМЕD 0,004 мл
9
б) 8 мл розділяючого 15% гелю
Н2О 4,6 мл
30% суміш акриламіду/метиленбісакриламіду 10,0 мл
1,5 М тріс-гліциновий буфер (рН 6,8) 5,0 мл
10% SDS 0,2 мл
10% амоній персульфат 0,2 мл
ТЕМЕD 0,006 мл
ПААГ фіксували 15 хв 15% розчином ТХО та зафарбовували протягом 2 – 3 год 0,25% розчином кумасі яскраво-голубого R 250 у суміші, що містила 10% оцтової кислоти і 40% етанолу. Гель відмивали 10% оцтовою кислотою.
10