3. Опис виконання практики згідно з календарним планом
Практику проходили на протязі чотирьох тижнів, за цей час нами було виконано такий обсяг роботи:
22.06 – інструктаж з техніки безпеки на кафедрі біохімії ЛНУ ім. Івана Франка, та на базі проходження практики.
23.06 - готувала посуд для подальшої роботи.
24.06 - готували небхідні для роботи розчини.
27.06 – 1.06 – виділення ферменту та аналіз його активності.
5.07 - готувала посуд для подальшої роботи.
6.07 – 7.07 – проводили електрофорез у ПААГ і промивали сорбент для подальшого використання.
8.07 – готували небхідні для роботи розчини та посуд.
11.07 – 12.07 – отримання препаратів апоферменту рекомбінантних аргіназ людини.
13.07 – 14.07 – аналіз кінетики реконструкції ферменту в присутності іонів металів.
15.07 – 18.07 – заповнювали щоденник практики та оформляли звіт про практику.
4. Завдання практики
1. Отримання препарату очищеної аргінази І людини із рекомбінантного штаму метилотрофних дріжджів H. Polymorpha.
2. Отримання препаратів апоферменту рекомбінантних аргіназ людини.
3. Аналіз кінетики реконструкції ферменту в присутності іонів металів.
6
5. Матеріали та методи досліджень
5.1 Об’єкти досліджень
Як продуцент внутрішньоклітинної аргінази І печінки людини використовували сконструйовані у відділі сигнальних механізмів клітини Інституту біології клітини НАН України рекомбінантний штам дріжджів NCYC 495 H. polymorpha: pGAP1-HsARG1 leu2car1 Sc:LEU2. Штам містить цільовий ген HsARG1 під контролем конститутивного промотора гена гліцеральдегіддегідрогенази.
5.2 Отримання безклітинного екстракту (БЕ)
Вирощені клiтини дріжджів промивали двiчi водою та один раз 30 мМ Хепес-буфером, рН 7,5 (ХБ). Осад клітин суспендували в ХБ, що містив 1 мМ ЕДТА та 0,4 мМ інгібітор протеїназ - фенілметилсульфонілфторид (фмсф) до концентрації клітин 90 – 100 мг/мл. Одержану суспензiю розливали у стаканчики для гомогенiзацiї, вносили склянi кульки (дiаметр 0,45 – 0,5 мм) в кiлькостi 3/4 вiд об'єму суспензiї i заморожували. Клітини руйнували на планетарному гомогенiзаторi упродовж 5 хв при 1000 об./хв +4 оС.
Для отримання БЕ гомогенiзати дріжджів центрифугували упродовж 20 хв при 14000 об./хв при +4 оС на центрифузі SORWELL. Для виділення ферменту відбирали супернатант.
5.3 Виділення та очищення рекомбінантної аргінази і людини
Джерелом для виділення внутрішньоклітинної форми рекомбінантної аргінази І людини служив штам NCYC 495 (pGAP1-HsARG1) метилотрофних дріжджів H. polymorpha. Фермент виділяли за допомогою колонкової афінної хроматографії із БЕ цього штаму на афінному сорбенті аргінін-макропористе скло[6].
Схема виділення цільового ферменту була наступною: розчин білка (БЕ) наносили на колонку (2 х 9,5см) з афінним сорбентом, зрівноважену 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5 і промивали стартовим буфером до п’яти об’ємів колонки. Фермент елюювали почергово 0,1 М, 0,5 М, 1 М 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5.
7
5.4 Визначення концентрації білка
Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі, який грунтується на утворенні забарвлених продуктів реакції ароматичних амінокислот з реактивом Фоліна у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв’язки . Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика.
Використовували реактиви :
Реактив А – 2 % Na2CO3 в 0,1 М NaОН;
Реактив В - 0,5 % CuSO4 в 1 % цитраті натрію;
Реактив С - 50 частин реактиву А + 1 частина реактиву В (готують безпосередньо перед використанням);
Реактив Д - реактив Фоліна, 1н (за кислотністю).
Отримані екстракти розводили в 25 - 100 разів водою, відбирали аліквоти по 0,5 мл. Додавали по 3 мл реактиву С, перемішували і через 10 хв вносили по 0,3 мл реактиву Д, знову перемішуючи. Через 40 хв проби фотометрували на спектрофотометрі СФ-46 в кюветі 1 см при l = 750 нм проти контролю (як контроль використовували реакційну суміш з 0,5 мл води замість зразку).
Концентрацію білка (мг/мл) визначали за формулою:
,
де D - оптична густина при l = 750 нм ;
n - розведення екстракту;
2,15 - коефіцієнт перерахунку.