МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ІВАНА ФРАНКА

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра біохімії

ЗВІТ

Про проходження навчально-виробничої практики

’’Дослідження кінетики реконструкції рекомбінантних форм аргінази І людини в присутності іонів металів.’’

Студентки групи БЛБ – 34

М.М. Свінтозельської

База практики:

Відділ аналітичної біотехнології

Інституту біології клітини НАН України

Термін практики:

22 червня 2011 р. – 19 липня 2011 р.

Керівники практики

від організації:

ст.н.с. Г. З. Гайда

від кафедри:

доц. І. В. Бродяк

доц. К. П. Дудок

Львів 2011

Зміст

Вступ……………………………………………………………………………………………………….3

1. Загальна інформація про організацію – базу проходження практики……………………………4

2. Інформація про структуру та організацію роботи біохімічної лабораторії; її забезпеченість реактивами, матеріалами та обладнанням……………………………………………………………….5

3. Опис виконання практики згідно з календарним планом…………………………………………6

4. Завдання практики……………………………………………………………………………………6

5. Матеріали та методи досліджень……………………………………………………………………7

5.1 Об’єкти досліджень…………………………………………………………………………….7

5.2 Отримання безклітинного екстракту (БЕ). …………………………………………………...7

5.3 Виділення та очищення рекомбінантної аргінази І людини…………………………………7

5.4 Визначення концентрації білка………………………………………………………………..8

5.5 Визначення активності аргінази……………………………………………………………….8

5.6 Електрофорез……………………………………………………………………………………9

6. Результати досліджень та їх обговорення…………………………………………………………11

6.1.Виділення рекомбінантної аргінази людини…………………………………………………11

6.2 Електрофорез……………………………………………………………………………………11

6.3 Отримання апоферменту рекомбінантних аргіназ……………………………………………12

6.4 Реконструкція аргінази в присутності іонів металів………………………………………….12

6.5 Спектральна характеристика аргінази…………………………………………………………15

Висновки……………………………………………………………………………………………….......17

ЛІТЕРАТУРА……………………………………………………………………………………………...18

2

Вступ

Аргіназа (Е.С.3.5.3.1; L – аргінін амідиногідролаза ) – це фермент, який відіграє вирішальну роль в циклі сечовини та гідролітично перетворює L- аргінін на L- орнітин та сечовину [1].

Аргіназа І складається з трьох тетраметрів, в кожній субодиниці – іон Mn²⁺, який є центром каталітичної активності [2]. рН-оптимум для очищеного фермента коливається в межах від 9,1 – 10. Температурна стабільність очищеного препарату є в межах від 50 – 60 °С, що вказує на те, що фермент є термостійким [3]. Щодо кінетичних параметрів, то константи Міхаеліса-Ментен сильно відрізняються для ферментів із різних джерел. Так, аргіназа із еритроцитів крові людини має величину 7 мМ, а аргіназа із насіння сої Glycine max – 83 мМ [4, 7, 8, 9]. Специфічність аргінази до дії субстрату залежить від присутності вільних гуанідинових груп, стереохімії та природи замісників.

Mn²⁺ є фізіологічним активатором, в той час як інші двовалентні метали: Fe²⁺, Co²⁺, Cd²⁺ проявляють інгібуючу дію [3]. Як визначено методом атомною абсорбції, повністю активована аргіназа людської печінки містить 1.1 ± 0.1 субодиниці мангану. Після дисоціації для інактивованої субодиниці зменшується інтенсивність виділення триптофану з ферменту під час флуоресценції при червоному спектрі. При додаванні до іонів Mn солей нікелю чи кобальту інактивована субодиниця перетворюється в активований мономер, і виділяє їх абсорбційно до олігомерних частин ферменту ( Мr=1200,000±2000). Заміна Мn на інші метали призводить до суттєвих змін в максимальній швидкості разом зі змінами Км для субстрату (аргініну чи канаваніну) [5].

У літературних джерелах зустрічаються дані, що іони Co – хороший замінник іонів Mn, при якому зростає активність аргінази І людини, що саме комплекси іонів Со, а не іонів Mn, Zn чи Ni можуть ефективніше каталізувати гідроліз аміногуанідину.

Застосування аргінази відкриває нові можливості для лікування багатьох видів ракових захворювань. Оскільки нові ліки володіють вибірковою здатністю, то вони діють лише на ракові клітини, не впливаючи при цьому на життєдіяльність нормальних клітин організму. Відповідно, препарат, що містить аргіназу, має значно менше побічних ефектів, ніж традиційна цитотоксична хіміотерапія. Більше того, новий склад ліків має більш стабільну формулу, ось чому аналогічний варіант досягається меншою кількістю препарату.

Метою роботи було:

- Виділення препарату аргінази І людини.

- Отримання апоферменту рекомбінантних аргіназ, позбавлених металів.

- Аналіз кінетики реконструкції ферменту в присутності іонів металів.

3

1. Загальна інформація про організацію – базу проходження практики

Дана робота виконувалась на базі відділу аналітичної біотехнології Іституту біології клітини НАН України. Відділ аналітичної біотехнології (ІБК-АБ) займається протягом останніх 10 років дослідженнями в області ензимології дріжджів та аналітичної біотехнології, розробкою нових біоаналітичних методів та аналітичних продуктів із використанням ферментів та генетично модифікованих клітин дріжджів та інших мікроорганізмів для кількісного визначення практично важливих аналітів в клініці та при моніторингу довкілля. У відділі проводиться також робота по вивченню гомеостазу деяких мікроелементів (хрому, селену) у дріжджів. Основними напрямками роботи відділу є:

Пошук, селекція та генно-інженерне конструювання мікробних надпродуцентів оксидо-редуктаз (алкогольоксидази, гліцеролоксидази, амінооксидази, формальдегіддегідрогенази, флавоцитохрому b₂,  аргінази) з потенційним біоаналітичним та біоремедіаційним значенням; виділення, очистка та вивчення фізико-хімічних, ензимологічних характеристик відповідних ферментів та перспектив їх біотехнологічного використання.

Розробка нових біосенсорних та ензиматичних методів аналізу практично важливих аналітів із використанням новітніх і рекомбінантних ферментів, а також генетично-модифікованих клітин дріжджів.

Вивчення шляхів редукційної детоксикації хромату клітинами дріжджів, характеристика біокомплексів хрому та дослідження їх можливого фармакологічного потенціалу.

Відділ аналітичної біотехнології очолює доктор біологічних наук, професор Гончар Михайло Васильович, який є автором 250 наукових та методичних праць, включаючи 133 статті (із них 50 - у провідних міжнародних журналах, із сумарним імпакт-фактором понад 90) та 7 патентів. Проф. Гончар є науковим керівником (або відповідальним виконавцем) 9-х міжнародних грантів (NATO, INTAS та ін). Має впроваджені біотехнологічні розробки - аналітичні набори для ферментативного визначення глюкози та етанолу ("ДІАГЛЮК", "ДІАГЛЮК-2", "АЛКОТЕСТ").

4

2. Інформація про структуру та організацію роботи біохімічної лабораторії; її забезпеченість реактивами, матеріалами та обладнанням

Для роботи були використані такі реактиви:

• 30 мМ тріс-HCl, pH 8,5 (очищений від металів).

• розчин мономерів “АА” для електрофорезу: 30% акриламід / 0,8% метиленбісакриламід.

• буфер “А” для розділяючого гелю складом: 375 мМ трис-HCl (pH 8,8); 0,4% тетраметилетилендиамін (TEМED).

- буфер “Б” для концентруючого гелю складом: 125 мМ трис-HCl (pH 6,8), 0,5% TEMED

• додецилсульфат натрію (SDS) — поверхнево-активна речовина, що в наукових дослідженнях використовується при гелевому електрофорезі для денатурації молекул білків і надання їм „-” заряду.

• 1 М аргінін-гідрохлорид, 0,2 М манган (ІІ) хлорид, 10 М натрій гідроксид, 2М тріс-ОН без pH – які використовували для приготування субстрату на аргіназу.

• Реагент №1 (кислий реагент), Реагент №2 (кольоровий реагент), стандарт сечовини, 16,65 мМ/л. - набір для визначення сечовини.

• ЕДТА (етилендіамінтетраацетату, EDTA) – поліамінокарбоксильна кислота з формулою [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂. Ця сполука є хелатинуючим агентом, тобто здатна зв`язувати іони таких металів як Ca²⁺ та Fe³⁺.

• Сорбент Chelex^® - матеріал для очищення розчинів від іонів металів.

5