Билеты_буракова

Билет №1

1. Что такое генетическая трансформация?

Генети́ческая трансформа́ция — изменение наследственных свойств клетки в результате внесения в нее генетической информации при помощи чужеродной изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и ее потомства новых признаков, характерных для объекта

— источника ДНК. Явление трансформации было открыто в 1928 году британским ученым Ф. Гриффитом, который показал возможность превращения непатогенных штаммов вирусов Streptococcus pneumoniae в патогенные штаммы, в результате взаимодействия с убитыми клетками патогенных штаммов. В 1944 году американец О. Эйвери установил, что трансформацию обеспечивают молекулы ДНК, которые являются носителями наследственной информации.

2.Какие вещества и в каких случаях используют для регуляции экспрессии гена целевого белка в бактериальных экспрессионных системах?

Сlac-опероном связываются репрессоры в отсутствии лактозы. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.

•Многие промоторы, особенно промоторы оперонов с генами, кодирующими белки метаболизма сахаров, регулируются как отрицательно, так и положительно. Подобный двойной контроль характерен, например, для lacпромотора оперона кишечной палочки, контролирующего экспрессию белков метаболизма лактозы. Репрессорный белок LacI связывается после lac-промотора (в положении от +1 до +21) при отсутствии лактозы и ингибирует транскрипцию генов lacZYA . В присутствии аллолактозы, которая синтезируется из лактозы ферментом бета-галактозидазой, (LacZ) или в присутствии негидролизуемого синтетического аналога (ИПТГ) белок-репрессор теряет аффинность к оператору. Ввиду того, что ИПТГ не подвержена гидролизу ферментами клетки E. coli, для индукции требуется меньшая концентрация этого вещества по сравнению с лактозой. Помимо отрицательного контроля, транскрипция положительно контролируется белком-активатором катаболитных оперонов, CAP-белком (англ. Catabolite activator protein). Эффективная транскрипция возможна только в присутствии активирующего комплекса CAP-белка и циклического AMФ. AMФ достаточно высока для инициации транскрипции только в условии отсутствии глюкозы. Таким образом, для э ной инициации транскрипции отсутствие глюкозы (к (или его негидролизируемого . Схема отрицательной регуляции лактозного оперона Активирующий комплекс перед началом

последо уменьшения зависимости инициации транскрипции от полной утил

. В свою очередь, концентрация циклического AMФ достаточно высока для инициации транскрипции только в условии отсутствии глюкозы. Таким образом, для э ной инициации транскрипции необходимо сочетание двух факторов глюкозы (катаболитная репрессия) и наличие негидролизируемого аналога ИПТГ). Триптофановый промотор является сильным промотором, при индукции экспрессии уровень транскрипции гена повышается примерно в 70 раз, и содержание рекомбинантного белка может составлять до 30 % всех белков клетки. В отличие от lac-промотора, trp-промотор контролирует экспрессию анаболических ферментов метаболизма триптофана − белков, катализирующих биосинтез триптофана. Когда содержание триптофана высоко, клетка не нуждается в его биосинтезе, и промотор репрессируется. L-арабиноза

может использоваться клетками кишечной палочки в качестве единственного источника углерода. Арабинозный оперон регулируется наличием или отсутствием глюкозы. низкий уровень глюкозы повышает уровень экспрессии, а высокий понижает Это потому, что арабиноза может использоваться клетками кишечной

палочки в качестве единственного источника углерода

3. Рассчитайте эффективность трансформации, если для нее использовали 1 мкл ДНК с концентрацией 60 мкг/мл, 50 мкл суспензии компетентных клеток и 200 мкл среды, на чашку Петри было высеяно 50 мкл культуры, в результате чего выросло 600 колоний бактерий.

Всего в пробирке: 1 мкл ДНК+ 50 мкл суспензии клеток+ 200 мкл среды= 251 мкл На чашку вылили только 50 мкл полученного раствора. Считаем сколько

ДНК содержится в этом объеме: 251 мкл-60мкг 50мкл-х мкг

Х= 11,952 мкг ДНК в 50 мкл (На одну чашку попало 11,952 мкг ДНК) Эффективность трансформации = число колоний на чашке / на кол-во ДНК на чашку (мкг) Эффективность трансформации = 600/11,952=50,2

Билет №2

1. Какими свойствами обладают компетентные клетки и для чего они используются?

Компетентная клетка – это те клетки, которые способны поглощать извне чужеродную ДНК. Например, состояние бактерии, при котором она может включать в себя экзогенные молекулы ДНК, т. е. быть реципиентом ДНК при трансфекции.

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими

свойствами:

•обладают сниженным уровнем метаболизма;

•более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;

•сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;

•меньшими размерами, чем некомпетентные;

•изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;

•повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой обработке;

•сниженным поверхностным зарядом.

Компетентные клетки широко используются в генной инженерии в качестве реципиентов векторных плазмид.

2. Опишите структуру плазмиды, изображенной на рисунке: За какие функции отвечает каждый из ее участков?

PUC18 является широко используемым вектором клонирования плазмиды в E. coli . Молекула представляет собой двухцепочечную кольцевую ДНК (длина 2686 пар оснований). Благодаря небольшому размеру pUC18 позволяет успешно клонировать крупные фрагменты ДНК .

Amp- Селективный маркер (ген устойчивости к антибиотику ампициллину, данный ген обеспечивает негативную селекцию нетрансформированных

стационарную фазу. Если индуктор добавлять сразу, то клеток в культуре будет мало, что снизит выход белка, если же добавить в позднюю фазу роста, то прибольшом количестве клеток белка будет мало, так как ресурсы питательной среды уже будут истощены и их будет недостаточно для синтеза

3.Как приготовить 200 мл раствора, содержащего 50 мМ фосфатного буфера рН 7.0, 0.3 М NaCl и 10 мМ имидазола, если имеется 2М фосфатный буфер рН 7.0, 5М раствор NaCl и сухой имидазол с Мw=68 г/моль.

1)Чтобы приготовить 200 мл раствора 50мМ фосфатного буфера рН 7.0 необходимо 5 мл 0,5М фосфатного буфера рН 7.0, 12 мл 5М раствора

NaCl

2)Теперь рассчитаем количество сухого имидазола: m=n*M=0,01*68=0,68 г сухого имидазола ( в 1 л раствора) 0,68*0,2=0,136г

Билет №5

1.Опишите структуру и принцип работы арабинозного оперона.

2.Какие соли можно использовать для создания градиента в анионообменной хроматографии?

NaCl (хлорид натрия), KCl (хлорид калия)

3.Рассмотрите профиль элюции. Что можно сказать об условиях проведенного хроматографирования, если для элюирования целевого продукта использовали градиент концентраций имидазола?

Это МЕТАЛЛ-ХЕЛАТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Белок содержит His-tag. Колонка мб никелевая

Белки с His-тагом (например, образующие тельца включения при синтезе в E. coli) можно растворить в буферах, содержащих 8 М мочевины,6 М гуанидин гидрохлорида, 1% лаурил-саркозина. рН белкового раствора должен быть в районе 7−8, для лучшего растворения возможно кратковременно повысить pH детергентов, денатурирующих агентов и pH должны быть подобраны). Колонку перед нанесением на неё растворённого белка необходимо уравновесить в том же буфере, что использовался при растворении, прокачав через неё около 5-ти объёмов буфера. После нанесения белка необходимо промыть сорбент буфером, использованным растворения, и далее при элюции также должны использоваться буферы, содержащие подобранное количество детергента.

Мембранные белки с His-тагом солюбилизируются в буферах, содержащих детергент (часто это 1% DDM) или систему детергентов (например, DDM/CHS 5/1). рН белкового раствора обычно выбирают в районе 7−8, (точные концентрации детергентов и pH должны быть подобраны). Колонку перед нанесением на неё солюбилизированного белка необходимо уравновесить в буфере с тем же содержанием детергента, что использовался при растворении мембранной фракции, прокачав через неё около 5-ти объёмов буфера. После нанесения белка необходимо растворения, далее применяют промывку колонки 8 мМ ATФ, промывают колонку буфером с меньшим содержанием детергента, но большим, чем CMC (для DDM это 0.01%). Элюцию белка проводят прокачивая через сорбент буфер с добавлением 300 мМ имидазола (в случае наличия 10 His), после чего удаляют имидазол из фракций диализом или гель-фильтрацией, так как

имидазол дестабилизирует мембранные белки. Все буфера кроме буфера для элюции могут содержать 5-30 мМ имидазола для исключения неспецифического связывания хелатным сорбентом белков.

Билет №6 1.Что такое селективный скрининг? Для чего его применяют?

Применяют для отбора трансформированных клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, и для поддержания стабильности плазмидной ДНК во время культивирования. В первом случае важно идентифицировать клетки, содержащие плазмиды с целевым геном, и отделить их от нетрансформированных клеток и клеток, несущих «пустую» плазмиду.

Маркером может служить устойчивость к антибиотикам. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с антибиотиками и погибают. Этот метод позволяет эффективно отделить трансформированные клетки от нетрансформированных, но не позволяет отделить клетки, несущие плазмиду с целевым геном, от клеток с «пустой» плазмидой.

Посмотрите на всякий случай табличку, мало ли, может спросит, какие антибиотики используют. Всем хорошего вечера))))))))))