Билеты_буракова

методы, то в контрольный образец вносится растворитель без белка в таком же объеме, как и в опытные и калибровочные образцы вносятся соответствующие растворы белка. Величину поглощения в кювете сравнения вычитают из величины поглощения опытного образца. Если в измеряемом растворе присутствуют детергенты (мочевина, гуанидин), то от них избавляются путем предварительного обессоливания образцов (Для измерения концентрации апобелков необходимо предварительно перевести его в раствор, не содержащие этих примесей с помощью гель-фильтрации (обессоливания)) Некоторые коммерческие наборы для определения концентрации белка содержат дополнительные добавки для нейтрализации небольших количеств детергента.

Вопрос 2. Какие подложки используют для проведения электрофореза и какие преимущества, и недостатки они имеют?

Используют твердые подложки.

Преимущества и недостатки:

1.На фильтровальной или хроматографической бумаге – +Сниженная конвекция, разделенные зоны можно зафиксировать и окрасить. Оборудование проще

- Непрозрачность. Загрязнения и неоднородность бумаги мешают разделению. “Хвосты” на электрофореграммах из-за высокой адсорбционной емкости. Фон окрашивается, что затрудняет распознавание белковых зон.

2.На пленках из ацетата целлюлозы +Быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая

адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. Пригодны для иммуноэлектрофореза.

-Непрозрачность в водных растворах (можно добиться прозрачности, погрузив в минеральное масло). Дороже, чем при использовании бумаги. Мало пригоден для препаративного электрофореза.

3.В крахмальном геле +первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно

препятствует конвекции. Повышает разрешение. -Низкая прозрачность, хрупкость, размер пор можно менять лишь в небольших пределах. Приготовление качественного геля трудоемко.

4.В агаровом и агарозном гелях +Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще

резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления.

-Из-за отрицательного заряда на сульфатных и

СООН-группах сетки агара возникает электроосмос, приводящий к неравномерному распределению электрического поля, а иногда – гидростатического давления. Возможно химическое взаимодействие веществ с агаром.

5.В полиакриламидном (ПААГ) геле +Химически инертен, можно кипятить. Можно задать необходимый

размер пор и обеспечить свойства молекулярного сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный.

-На сегодняшний день наилучший носитель, но готовится из акриламида - ядовитого вещества.

Так же можно сказать, что помимо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов.

Вопрос 3. Как приготовить 120 мл уксусной эссенции из ледяной уксусной кислоты?

Уксусная эссенция это 70% раствор уксусной кислоты.

Ледяная уксусная кислота – это кислота, концентрация которой близка к 100%, она замерзает при +16,5 град, образуя твердые кристаллы.

100х=120*70

100х=8400

х=84 мл надо ледяной уксусной кислоты

Отсюда следует, 120-84=36 мл воды необходимо для того, чтобы сделать раствор.

Билет №13 1. Каким образом происходит процесс проникновения плазмидной

ДНК в компетентные клетки при трансформации?

Целостность мембраны нарушают физическим, либо химическим? воздействием.

Это можно осуществить с помощью теплового шока, когда компетентные бактериальные клетки на короткое время помещаются на водяную баню, а затем в лед. Затем добавляют к ним плазмиду.

Она проникает через поврежденную мембрану. Далее мембрана восстанавливается при инкубации образца, например, с SOC-раствором.

2. Какими методами осуществляют визуализацию разделенных с помощью электрофореза молекул?

1.молекулы в геле могут быть окрашены с помощью бромида этидия. Молекулы будет видно за счет флуоресценции под ультрафиолетовым светом

2.После проведения электрофореза гель окрашивают Кумаси синим или серебром.

Можно использовать флуоресцентные красители SYPRO красный или SYPRO оранжевый, которые нековалентно связываются с белками. (Пятна белков, окрашенных флуоресцентными красителями, детектируют с помощью устройств с лазерным возбуждением флуоресценции).

3. Рассмотрите профиль элюции. Что можно сказать о типе хроматографии и об условиях хроматографирования?

Так-с, ось У слева – оптическая плотность жидкого образца при длине волны

280нм (такое значение, потому что ароматические аминокислоты тирозин, фенилаланин и триптофан поглощают свет в дальней ультрафиолетовой области при 260-280 мм.).

Ось У справа – кондуктивность, которая обозначает, как я поняла электропроводность раствора. Ну и по оси Х у нас объем всего образца, который мы прогоняли через хроматограф, чтобы собрать нужное вещество, это пики.

Иными словами пики отображают разделение катионов или анионов на ионнообменнике.

Это ионообменная хроматография – высокоэффективная жидкостная.

(Метод основан на эквивалентном обмене ионов раствора на ионы неподвижной твердой фазы).

Для хроматографии использовали колонку.

(Если, что в колонке элюент с отрицательным или положительным зарядом)

Билет №14 1. Какие способы трансформации бактериальных клеток существуют?

Вприроде чужеродная ДНК может попадать в клетки в нескольких процессах: 1) при переносе ДНК в виде плазмиды, вирусного или фагового генома (конъюгация, трансдукция, инфекция); 2) при передаче ДНК непосредственно в клетки (трансформация).

Клетки, получившие чужеродный генетический материал, называются трансформированными. Методами генетической инженерии можно вводить гетерологичную ДНК в клетки.

ПЛАЗМИДЫ

Плазмиды встречаются в основном в бактериальных клетках. Они представляют собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, которая может встраиваться в хромосому клетки-хозяина или реплицироваться вне ее.

Всостав плазмиды входит сайт начала репликации, а также один или несколько важных для бактерии генов (например, гены устойчивости к антибиотикам). Плазмидную ДНК несложно отделить от ДНК хромосомы, а затем ее можно подвергнуть обработке ферментами. Таким образом получают векторы для клонирования и экспрессии чужеродных генов. Как правило, плазмидные векторы содержат несколько функционально важных элементов: 1) сайт начала репликации (ori), без которого невозможна репликация в клетке-хозяине; 2) иногда в плазмидный вектор встраивают дополнительный сайт начала репликации для размножения в других клетках-хозяевах (shuttle – челночный вектор); это позволяет проводить операции с генетическим материалом, используя чаще всего клетки-хозяеваE. coli, а затем уже модифицированный вектор вводить в клетки исследуемого организма; 3) участок ДНК, содержащий уникальные сайты расщепления рестриктазами (MCS –multiple cloning sites); такой «полилинкерный» участок необходим для встраивания клонируемых фрагментов; 4) один или несколько селективных маркеров, позволяющих отличать клетки, несущие плазмиду, от нетрансформированных клеток (например, маркеры, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам или ауксотрофность). Чтобы облегчить поиск трансформированных клеток, в плазмидный вектор встраивают репортерный ген. При так называемом «бело-голубом» скрининге клонов после трансформации плазмидой pUC в качестве репортерного гена служит ген lacZ', так как в ней MCS фланкирован последовательностью гена α-пептида β- галактозидазы (lacZ'): в используемых клеткахE. coliэтот ген отсутствует в результате делеции, поэтому только трансформированные клетки способны

синтезировать β-галактозидазу. Преимущество этого маркера заключается в том, что на агаре с 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозидом (X-Gal) трансформированные клетки образуют колонии характерного голубого цвета. Появление такой окраски обусловлено наличием 5,5'-дибром-4,4'- дихлориндиго– продукта расщепления X-Gal β-галактозидазой. В случае встраивания фрагмента в MCS колонии остаются белыми. Относительно небольшой размер плазмидых векторов (обычно не более 10 т.п.н.) облегчает процедуру выделения плазмиды, а также уменьшает вероятность негативной селекции при клеточном делении. Большинство плазмидных векторов разработаны для клеток E. coli, однако также имеется ряд плазмид для Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, лактобактерий и других важных для биотехнологии организмов. У эукариот плазмиды встречаются очень редко. В качестве примера можно привести 2 -плазмиду дрожжей Saccharomyces cerevisiae. На основе Ti-плазмиды почвенной бактерииAgrobacterium tumefaciensсозданы векторы для трансформации двудольных растений.

БАКТЕРИОФАГИ И ВИРУСЫ

В природе передача генетического материала клетке-хозяину происходит при вирусной или фаговой инфекции. В лаборатории в качестве векторов используют ослабленные бактериофаги и вирусы, не способные к осуществлению лизиса и других патогенных действий из-за соответствующих модификаций генома. Практически для каждого рода бактерий описаны фаги, специфически инфицирующие только представителей данного рода. Многие из них широко используются в генетической инженерии, в том числе фаги λ и М13, поражающие клетки E. coli. Векторы на основе вирусных геномов часто применяют для трансформации животных и растительных клеток, а также при генной терапии человека и животных.

НЕБИОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ТРАНСФОРМАЦИИ

сочетают в себе химические и физические методы. Выше мы уже рассказывали о трансформации клеток растений. Для трансформации животных клеток, лишенных клеточной стенки, или растительных протопластов* ДНК в виде кальциевой соли осаждают на поверхности клеток, и ее попадание внутрь клетки происходит в результате эндоцитоза. При электропорации под действием короткого электрического импульса в клеточной мембране временно образуются поры, достаточно большие для проникновения молекул ДНК в клетку. Липофекция – способ введения ДНК в клетки, при котором осуществляется слияние клетки с липосомой, содержащей ДНК. Для трансформации эукариотических клеток часто проводят микроинъекцию ДНК непосредственно в клеточное ядро. Как правило, для достижения высокой эффективности трансформации любой из указанных методов требует определенной оптимизации в соответствии с выбранным типом клеток и вектором.

2. Опишите принцип определения концентрации белка по Лоури.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на

пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10 — 100 мкг белка в пробе). Ha развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дитиотреитол в концентрации 0,01 —0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комплексоны (ЭДТА в концентрации0,5 мМ), детергенты (тритон X100 в концентрации 0,1 — 0,2 % вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации 0,15 %, сахароза в концентрации 10 % и др. В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по методу Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. B некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах, или очистка белковых растворов от низкомолекуляриых компонентов путем диализа или гельфильтрации на сефадексе G-25.

Интенсивность окраски комплекса, которая пропорциональна количеству белка в исследуемой пробе, измеряется спектрофотометрически.

Билет №15

1.Какими свойствами должен обладать экспрессионный бактериальный штамм для успешной экспрессии генов белков? Выбор экспрессионного штамма

Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.

Бактерии штаммов B предпочтительны для производства рекомбинантных белков ввиду нескольких ключевых свойств. Штаммы этой линии не обладают жгутиками, тем самым сохраняя клеточные ресурсы, что выражается в лучших ростовых свойствах и большем выходе биомассы клеток. Клетки этой линии лучше усваивают глюкозу из среды, при культивировании образуют меньше уксусной кислоты, даже при высокой концентрации глюкозы в среде [13]. Кроме того, штаммы B, по сравнению с K-12, эффективнее секретируют белки в периплазматическое пространство. В клетках E. coli линии B биосинтез аминокислот проходит активнее, клетки обладают дополнительной системой секреции II типа, отличаются строением наружной мембраны (синтезируют больше 30 поринов OmpF с большим диаметром пор) и клеточной стенки [14]. Больший выход рекомбинантных белков также обусловлен меньшей

деградацией экспрессируемых белков во время выделения и очистки ввиду меньшего содержания протеолитических ферментов (отсутствует Lon-протеаза).

Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных белков необходимо обеспечить стабильность плазмидного вектора, стабильность, эффективность транскрипции и трансляции мРНК целевого гена, устойчивость транслированного полипептида, корректный фолдинг экспрессируемого белка.

2.Какими способами осуществляют денатурацию белков при проведении электрофореза?

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле используется для оценки качества белков. Перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации нагреванием с сильным анионным детергентом — натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН и принимают вид стержня, несущего сильноотрицательный заряд. Величина этого заряда зависит только от величины молекулы белка. ДСНполипептидные комплексы мигрируют в геле со скоростью, зависящей от размера полипептида. Миграция этих комплексов происходит в направлении к аноду, при этом комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими молекулярными массами. С помощью смеси стандартных белков известной молекулярной массы определяют зависимость подвижности молекул от их молекулярной массы, а наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.

Классификация электрофоретических методов Основными типами электрофореза являются:

-зональный электрофорез,

-изотахофорез,

-изоэлектрическое фокусирование,

-иммуноэлектрофорез.

•Зональный электрофорез ведется при постоянном (не изменяющемся) значении рН буферного раствора, заполняющего данный носитель (бумагу, гель, др.). Исследуемый образец наносится пятном или тонким слоем на носитель, по которому и перемещается в электрическом поле. Усложненным вариантом зонального электрофореза является диск-электрофорез (многофазный зональный электрофорез), при котором рН и другие характеристики, постоянные внутри одной “фазы”, при переходе к другой “фазе” скачкообразно изменяются.

•При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания градиента рН обычно используют раствор полиаминополикарбоновых кислот, которым насыщают носитель. В отсутствии электрического поля эта смесь обычно имеет рН=6,5. При наложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3 до 10.

•В случае изотахофореза заряженные ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с одинаковыми и постоянными скоростями.

•Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реакции “антиген – антитело”. Этот тип электрофореза превосходит остальные по чувствительности и разрешающей способности.

По цели различают:

-аналитический (для анализа состава смеси, реже – для получения малых количеств разделяемых веществ) электрофорез,

-препаративный (для получения препаратов - значительных количеств чистых веществ) электрофорез.

По степени денатурации разделяемых белков различают

-нативный электрофорез,

-электрофорез в денатурирующих условиях.

Вотличие от нативного электрофореза, электрофорез в денатурирующих условиях предполагает применение химических реагентов, разрушающих пространственную структуру разделяемых белков.

По направлению фракционирования выделяют электрофорез, при котором белки движутся в одном направлении, и двумерный электрофорез, при котором сначала проводят разделение в одном направлении, а затем – в направлении, перпендикулярном первому. Двумерный электрофорез позволяет резко увеличить разрешающую способность при разделении смесей, состоящих из большого количества разных белков.

В зависимости от ориентации носителя (геля, бумаги, др.) электрофорез может быть вертикальным или горизонтальным.

Классификация по типу носителя жидкой фазы представлена в таблице 1.

Она также отражает развитие электрофоретических методов в 10 историческом аспекте. Первым был разработан электрофорез без какого-либо носителя: электрическая цепь между электродами замыкалась через буферный раствор, в котором и происходило разделение белков. Позднее при

электрофорезе начали применять носители жидкой фазы – полимеры, служащие “каркасом” для буфера. Применение носителей позволило заметно снизить конвекцию (перемешивание) и, следовательно, повысить качество разделения белков. Носитель может быть в форме порошка, пленки, геля и др. Последующие разработки были посвящены усовершенствованию свойств носителей.

Идеальный носитель должен:

а) резко снижать конвекцию;

б) быть простым в приготовлении;

в) иметь высокую теплопроводность (при низкой теплопроводности трудно охлаждать систему);

г) обладать низкой адсорбционной емкостью и химической инертностью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу;

д) не иметь заряда на поверхности частиц, чтобы не вызывать эндоэлектроосмос. Если разделяемые белки заряжены отрицательно, то при электрофорезе они должны двигаться к аноду (+), однако эндоэлектроосмос “тянет” их в другую сторону, к катоду (-), мешая электрофоретическому разделению.

Гели легко принимают разные геометрические формы, поэтому в названии электрофоретического метода с их использованием указывают, какова конфигурация рабочего пространства. Гель для электрофореза можно заполимеризовать:

-в трубках,

-в капиллярах,

-в пластинах (“слэбах” – от англ. slab),

Основной недостаток электрофореза в трубках - это отсутствие теплооттока: температура в центре цилиндра геля оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу белковых зон. На одну трубку наносится одна исследуемая проба.

Повысить теплоотток можно, применяя очень тонкие трубки - капилляры. В тонких пластинах также достигается гораздо более эффективное отведение тепла, чем в трубках. Так, при воздушном охлаждении эффективный теплоотвод возможен при силе тока 50 — 100 мА на вертикально расположенную пластину (то есть рассеиваемая в виде тепла мощность не превышает 20 Вт). Кроме того, конфигурация пластины позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить разделение сразу нескольких (10 - 13) проб белка. Пластины легко сканировать и удобно разрезать. По сравнению с цилиндрическими гелями гелевые пластины позволяют значительно уменьшить концентрацию белка в наносимой пробе.