2.2.3.Статистична обробка результатів.
Для статистичної обробки використовували пакет аналізу даних прикладної програми MS Excel. Для обчислення площі зон дегенерацій використовували двофакторний t-тест з різними дисперсіями. Рівні значущості позначали “*” для P≤0,05, “**” для P≤ 0,01, “***” для P≤0,001.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ
Лікування нейродегенеративних порушень не лише спадкових, але й тих, що виникли в результаті розвитку органічного ураження мозку, залишається невирішеною проблемою сучасності, адже з кожним роком у світі спостерігається тенденція до зростання кількості людей, які страждають на подібного роду захворювання [1]. Найбільш сумнозвісні нейродегенеративні патології людини (синдром Паркінсона, хвороби Альцгеймера, Хантінгтона, Шарко-Марі-Туз та ін.) пов’язані з втратою великої кількості нейронів у певних ділянках мозку. Вони, як правило, починаються у пострепродуктивному віці та закінчуються передчасною смертю. Деякі гени відповідальні за появу спадкових деменцій, ідентифіковано [2], однак молекулярні характеристики виникнення таких патологій залишаються невідомими, що ускладнює розробку терапії.
Існує низка нових лікарських засобів пептидної природи, що можуть мати терапевтичний ефект у лікуванні як гіпоксичних, так і нейродегенеративних розладів, однак механізм їх дії залишається не до кінця розкритим. Одним із таких засобів є експериментальний нейропротектор Мітохондрин-2 (М-2), отриманий з окремих тканин новонароджених поросят, що пережили гіпоксію під час пологів і який являє собою набір пептидів з молекулярною масою в діапазоні 2500-7000 Да та низки домінуючих амінокислот [3].
Зважаючи на складність проведення клініко-генетичних досліджень у людини, для вивчення природи нейродегенеративних захворювань та пошуку терапевтичних підходів використовують модельні об’єкти. Одним з найкраще вивчених еукаріотичних модельних об’єктів генетики є Drosophila melanogaster. На сьогоднішній день встановлено, що багато описаних генів дрозофіли є ортологами генів людини. Крім того, патологічні зміни в структурі мозку нейродегенеративних мутантів дрозофіли за морфологічними, біохімічними та функціональними характеристиками подібні до таких у людей, які страждають нейропатіями [4]. Тому особливу цінність представляють точкові мутанти дрозофіли із нейродегенеративними змінами у мозку та трансгенні лінії дрозофіли, які дозволяють створювати спрямований функціональний нокаут окремих генів у певних типах клітин, а їх детальне вивчення дає змогу не лише поглибити розуміння генетичної природи патології, але й створює підґрунтя для дослідження експериментальних нейропротекторних препаратів.
Для дослідження дії експериментального препарату М-2 нами було обрано особин із тканинно-специфічною експресією гена Sod1 у гліальній тканині мозку дрозофіли. Відомо, що ген Sod1 характеризується клітинно-специфічною активністю [9, 14]. Серед клітин мозку саме для гліоцитів його функціонування є найбільш вагомим [15]. Використання Gal4-UAS системи тканинно-специфічної експресії дозволяє створювати функціональне інгібування трансляції генного продукту в визначених тканинах або клітинах. Ми створили функціональний нокаут гена Sod1 у гліоцитах, схрестивши дві лінії: в одній під контролем UAS промотора містився конструкт сенс- і антисенс-кодуючі послідовності гена Sod1 (UAS- Sod1-RNAi), а драйверна Gal4 лінія (Repo-Gal4) забезпечувала активацію цього конструкту в гліоцитах. Особини необхідного генотипу (Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi) одержували у першому поколінні. Контролем патологічного фенотипу в даному випадку не може слугувати дикий тип, оскільки відомо, що драйверні лінії можуть мати власний неспецифічний фенотип [8, 9]. Тому контролем були особини F1 від схрещування драйверної лінії з диким типом (Repo-Gal4/+).
У попередніх роботах нашої лабораторії було показано, що як функціональний нокаут, так і надекспресія гена Sod1 у гліальній тканині призводять до виникнення нейродегенеративних змін у структурі головного мозку D.melanogaster [12,13]. Нейродегенерація локалізується в очній ділянці мозку і поширюється не лише на нейрони, але і на гліальні клітини – гліоцити (рис.6).
(а)
(б)
Рис. 6. Схеми схрещувань ліній D. melanogaster для отримання тканинно-специфічної експресії гена Sod 1: (а) − створення функціонального нокауту гена Sod1; (б) – отримання драйверної лінії, для активації конструкту у гліальних клітинах.
Стандартним способом згодовування експериментальних засобів та речовин в дослідженнях на дрозофілі є личинкове згодовування [10]. Оскільки, ми досліджували характеристики нейродегенерації, що властива старіючому організму, то оцінювали фенотип старих 21-денних особин.
Ми провели аналіз гістологічних зрізів тканини мозку 21-денних самців трансгенних особин та контрольних особин Repo-Gal4/+, які споживали експериментальний препарат М-2 та вирощувалися без нього.
При аналізі фенотипу тканини мозку мух з генотипом Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi із функціональним нокаутом гена sws у гліоцитах було виявлено специфічний фенотип. А саме, в ділянці, що відповідає переходу ламіни у ретину та медулу, де найбільша концентрація гліоцитів, виявлено значну вакуолізацію тканини мозку (рис. 7). У контрольних особин з генотипом Repo-Gal4/ + спостерігалася суцільна структура тканини у цій ділянці мозку.
У контрольних особин Repo-Gal4/ + після вживання М-2 не виявлено фенотипових змін тканини мозку. У дослідних особин Repo-Gal4/UAS- Sod1-RNAi після споживання засобу М-2 зберігалися патологічні зміни у тканині мозку аналогічні тим, що були у нелікованих мух.
Оскільки помітних візуальних змін при аналізі тканини мозку не виявлено, необхідно було зробити кількісний аналіз нейродегенеративних зон. Ми обрахували площу вакуолей, аналізуючи мікрофотографії за допомогою графічного редактора Kompas 13 portable mini. Було з’ясовано, що середня площа вакуолей 21-денних особин вирощених на стандартному середовищі, складала 141,521±12,36 мм2, після личинкового згодовування М-2 площа вакуолей зменшилася та становила 106,81±14,17* мм2, що є достовірною відмінністю (табл. 1).
Таблиця 1
Умовна площа зон дегенерації у тканині мозку особин D. melanogaster із функціональним нокаутом гена Sod1 у гліальних клітинах в контролі та після згодовування препарату М−2
ГЕНОТИП N=10 |
Площа зон дегенерації, мм2 21- денні особини |
|
K (M±m) |
+M−2 (M±m) |
|
Repo-Gal4/+ |
0 |
0 |
UAS-Sod1-RNAi/Repo-Gal4 |
141,521±12,36 |
106,81±14,17* |
а)
б)
Рис. 7. Гістологічні зрізи мозку: а) контрольних особин Repo-Gal4/ +;
б) особин із функціональним нокаутом гена Sod1 UAS-Sod1-RNAi/Repo-Gal4 (збільшення15×40)
Встановлено, що засіб М-2 містить у своєму складі компоненти, які здатні чинити нейрпротекторний ефект на клітини мозку старих особин дрозофіли за умови личинкового згодовування.
У трансгенних особин з дисфункцією гена Sod1, які споживали препарат, спостерігається зменшення зон дегенерації у мозку дрозофіли.