2.1. Матеріалом дослідження слугували лінії d. Melanogaster:
– UAS-Sod1-RNAi – експресує dsRNA для RNA інтерференції гена Sod1, під контролем UAS промотора;
– Repo-Gal4 – специфічно експресує Gal4 y гліальній тканині;
Контролем були: лінія дикого типу Oregon R, вихідні трансгенні лінії у гетерозиготному стані UAS-Sod1-RNAi /Oregon R, , Repo-Gal4/Oregon R.
Тканинно-специфічну експресію генів здійснювали за допомогою бінарної UAS-Gal4 системи [25] (рис.5)
Рис. 5. Бінарна UAS-Gal4 система експресії генів
2.2. Методика культивування дрозофіли в нормі та за умов введення препарату м-2
Мухи утримувались при температурі +24 ‒ +25С у термостаті в цукрових стаканчиках.
Для личинкового згодовування препарат М-2 додавали до стандартного поживного середовища [10], яке згодовували лише личинкам. Дорослі особини утримували на середовищі без досліджуваного засобу. Контролем слугували особини того ж генотипу, які утримувались за аналогічних умов та не споживали досліджуваний засіб.
М-2 вносили в поживне середовище перераховуючи концентрацію максимальної добової дози для людини (26 мкл) на 100 мл стандартного поживного середовища [10].
2.2.1. Виготовлення гістологічних препаратів зрізів мозку
Для отримання постійних препаратів тканини головного мозку із особин певного віку досліджуваних ліній ми використовували стандартну методику [26]. Особин підморювали і поміщали в колери, строго зафіксовуючи положення живих об’єктів. Фіксацію проводили у розчині Карноя, що складається із етанолу, хлороформу і оцтової кислоти у співвідношенні 6:3:1 протягом 12 годин при температурі 4°С.
Далі проводили дегідратацію і відмивання препаратів у спиртах: три рази по 5хв у етанолі (96°) і 10хв у абсолютному спирті (100°) при кімнатній температурі. Потім проводили повторне фіксування зрізів. Цього досягали шляхом інкубування отриманих зразків при температурі 65°С протягом 30-ти хв. в метилбензоаті, в суміші метилбензоату та парафіну у співвідношенні 1:1 протягом 40 хв. при температурі 65°С і двічі по 40 хв. у парафіні при температурі 65°С.
Після парафінування виготовляли парафінові блочки, котрі потім використовували для безпосереднього виготовлення гістологічних зрізів мозку дрозофіли. Зріз товщиною 7мкм одержували на ротаційному мікротомі. Смужки отриманих секцій переносили у теплу воду для розправлення парафіну, і потім на предметні скельця. Скельця із зрізами висушували, після чого проводили відмивання від парафіну у суміші ксилолів, двічі по 7-10 хв.
Готові зрізи заливали клеєм DPX та накривали покривними скельцями для отримання постійних препаратів. Аналіз проводили на мікроскопі Laboval – 3 Carl Zeiss Jena із використанням флюорисцентного світла.
2.2.2. Обчислення площі зон дегенерацій
Обчислення площі вакуолей у тканині мозку трансгенних особин проводили за допомогою аналізу мікрофотографій у графічному редакторі Kompas 13 portablemini, який дозволяє обчислювати загальну кількість пікселів виділеної ділянки на фотографії з подальшим автоматичним переведенням даного показника в міліметри, враховуючи роздільну здатність опрацьованого зображення. Аналізували не менше 10 особин кожного генотипу.