1.2. Дослідження експериментальних препаратів з використанням Drosophila melanogaster, як модельного об’єкта

Оскільки виявлено значну подібність у прояві дегенеративної патології безхребетних та людини, вивчення мутантів дрозофіли дозволяє не тільки поглибити розуміння генетичної природи патології, але і створює підгрунтя для дослідження терапевтичних засобів. Зокрема, вивчали вплив як відомих медикаментів, так і експериментальних препаратів. Серед них пірацетам, верапаміл, арісепт, церебролізин, карнозин та експериментальні засоби такі як церебрал і адемент [13].

Класичним нейропротектором є пірацетам (ноотропіл), це 2-оксо- 1- піролідинацетимід з групи ноотропів [16]. Пірацетам є дві особливості: нейрональну – нейропротекція і судинну – покращення мозкового кровообігу. Засіб змінював швидкість проходження процесів збудження у мозку, покращував нейрональну пластичність і метаболізм, сприяючи активації синтезу ДНК, фосфоліпідів та ряду кіназ у нейронах. Препарат зменшує агрегацію тромбоцитів, а при порушенні еластичності цитомембран еритроцитів покращував їх здатність до зміни форми і проходження по судинах мозку. Пірацетам долає гематоенцефалітичний і плацентарний бар’єри, характеризується високою ефективністю при лікуванні нервових розладів у людей і дослідних тварин із експериментальною патологією.

Верапаміл застосовують в якості нейроретардатора [16]. Він володіє здатністю нормалізувати порушення серцевого ритму. Верапаміл зменшує потік іонів Ca через повільні специфічні канали. Препарат викликає розширення артерій, сприяв активному кровопостачанню мозку. Він захищає нейрони при гіпоксії.

Поодиноке окреме використання пірацетаму, церебралу чи верапамілу відтерміновує появу нейродегенерацій у досліджуваних комах. Їх фенотип характеризується лише незначними початковими змінами нервової тканини. Використання комбінації нейропротектор + нейроактиватор є більш ефективним ніж поодинокий варіант застосування засобів. Але абсолютне відновлення фенотипу тканини мозку до нормального у 15- денних імаго спостерігається лише у випадку використання засобів з різним механізмом дії за трохетапною схемою: нейропротектор (пірацетам) + нейроактиватор (церебрал) + нейроретардатор (верапаміл).

Ефективність дії трьох етапної схеми була прослідкована на гістологічних зрізах 17-, 20-, 25- і 30- денних мух. Контролем слугували мухи з нейродегенеративними патологіями, які на етапах досліду утримувались на стандартному середовищі з додаванням води. Починаючи з 17–го дня життя особин в контролі спостерігалась прогресуюча нейродегенерація. Структура мозкової тканини була пориста з чітко вираженими отворами.У 17-ти денних імаго після впливу трьох препаратів фенотип досліджуваних мутантів залишався аналогічним інтактному дикому типу. Лише з 20–го дня структура головного мозку мутантів починала руйнуватись, а прогресуюча нейродегенерація з’являлась на 25-й день життя досліджуваних імаго.

Арісепт є зворотнім інгібітором ацетилхолін естерази [12]. Інгібуючи холіноестеразу в головному мозку, блокує розпад ацетилхоліну, що здійснює передачу збудження в ЦНС. Одноразовий прийом супроводжується пригніченням активності холін естерази. Уповільнює прогресування хвороби Альцгеймера, коригує поведінкові порушення, зменшує апатію, галюцинації і неосмислені повторювані рухи.

Церебролізин – нейротрофічний і нейрозахисний засіб, у склад якого входять біологічно активі пептиди [1]. Протеолітична пептидна фракція, одержана з мозку свиней, стимулює диференціацію клітин, покращує функцію нервових клітин і активує механізми захисту і відновлення; експерименти на тваринах продемонстрували, що безпосередньо впливає на нейрональну і синаптичну пластичність, що сприяє поліпшенню когнітивних функцій [12].

Багатьма авторами показана також імовірна терапевтична роль карнозину, пов'язана з його нейромодуляторною та нейропротекторною дією. Карнозин є дипептидом, що складається із залишків амінокислот бета-аланіну і гістидину. Виявлено у високих концентраціях в м'язах і тканинах мозку [12].

Аналіз кривих виживання показав, що для мутантних ліній вплив арісепту виявився однозначно позитивним – показники тривалості життя збільшились. Так, показники максимальної тривалості життя зросли на 22 – 33%, а середня тривалість життя – на 12 – 87%.

Для нейропротектора церебролізину, у ряді випадків, також простежувався позитивний ефект. Він збільшував загальну тривалість життя особин на 10-15 діб, а також підвищував їх життєздатність.

Карнозин виявив неоднозначну дію. Спостерігалось збільшення показників тривалості життя: максимальна тривалість життя зросла на 6– 17%, а середня – на 27 – 90%. Тобто дія на нейродегенеративних мутантів дрозофіли нейропротекторів церебролізину і карнозину є подібною, однак менш ефективною, ніж дія арісепту.

Церебрал — це екстракт водорозчинних молекул, виділених з цереброкортексу тварин, які перенесли геморагічний інсульт [16]. Після такого інсульту у тварин відбуваються активні регенеративні та репаративні процеси, стимулюється ріст нейритів та синапсотворення. Церебрал підсилює синтез NGF (фактор росту нейронів) і виявляє модулюючі впливи на імунну систему. Активна фракція церебралу містить пептиди з молекулярною масою 350-500 Дa. Препарат застосовують в якості нейроактиватора.

Аналіз гістологічних зрізів головного мозку 10-денних мух показав, що при використанні церебралу мозкова тканина залишається повністю неушкодженою.

Таким чином, дані препарати: пірацетам, верапаміл, арісепт, церебролізин, карнозин та церебрал володіють позитивним терапевтичним ефектом, який проявляється у збільшенні тривалості життя і відтермінуванні уражень мозку. Всі дослідження проводились на модельному об’єкті генетики D. melanogaster. Описано велику кількість нейродегенеративних мутантів D. melanogaster, в нейронах яких розвиваються зміни, аналогічні тим, що ідентифікуються при нейродегенераціях людини.

Мітохондрин – це експерементальний препарат для лікування важких гіпоксичних станів і мітохондріальних дисфункцій. Цей засіб для лікування гіпоксій виділяють із вмісту мітохондрій, отриманих із тканин та органів новонароджених поросят, що народилися другими і до останнього в потомстві, тобто тих, що перенесли внутрішньоутробну гіпоксію. Мітохондрин було створено Макаренком А.Н., Кульчиковим А.Е., Морозовим С.Г., Широбоковою Л.П., Божком А.М. [7, 27 ].

Відомо, що мітохондрії, гранулярний ендоплазматичний ретикулюм, цитомембрани нейронів ембріонів новонароджених ссавців (зокрема, людини) в порівнянні із такими у статевозрілих особин відрізняються підвищеною стійкістю до впливу гострої й хронічної кисневої недостатності різного генезу, збереженням функцій нейронів, ефективнішим відновленням порушень мозкових функцій в постгіпоксичному періоді. Це дозволило припустити його присутність в ультраструктурах клітин ендогенних антигіпоксичних чинників, які можна було б використовувати як засоби для профілактики і лікування хворих на ранньому і пізньому періодах після перенесеної гіпоксії.

Для отримання препарату Мітохондрину–2 в якості вихідної сировини використовують тканини і цілі органи новонароджених молозивних поросят, які з 18-20 год до забою піддавалися у природних умовах пологового акту багаторазовому впливу на організм жорсткої гіпоксії, яка найчастіше впливає на тих поросят, які народилися останніми. З організму поросят брали тканини і цілісні органи (головний мозок, печінку, підшлункову залозу, серце, легені, нирки, кишечник, шлунок, жирову тканину, шкіру, поперечно-посмуговані м'язи, селезінку), а також плаценту.

Для одержання препарату проводили дроблення і гомогенізацію (в трис-НС1 буфері з додаванням 0,32 М сахарози, рН 7,4, щонайменше 1:10) органів та тканин новонароджених поросят, народжених другими і далі в потомстві, тобто тих, які піддаються багаторазовому впливу на організм плоду жорсткої гіпоксії, що розвилася під час родів та яка надає найбільш виражену дію на особин, що народилися останніми. Потім з отриманого гомогенату тканин різних органів отримують загальний гомогенат (рН=7,3-7,6), відокремлюють нерозчинні фрагменти зруйнованих тканин центрифугуванням при 500 об/хв. Отриману рідку суміш (супернатант) позбавляють ядер клітин, піддаючи градуальному центрифугуванню. З отриманого супернатанта отримують неочищену мітохондріальну фракцію (Р2) з допомогою центрифугування. Осад ресуспендує в середовищі гомогенізації. Отриману суспензію заморожують за температури -20° С і прискорено розморожують, домагаючись пошкодження мембран мітохондрій, крист і виходу у середовище для гомогенізації вмісту мітохондрій. Отриману рідку суміш після відділення ультраструктурних фрагментів (у процесі чергового центрифугування) змішують з гексаном у співвідношенні 1: (3-5), яке дозволяє досягнути максимально можливої екстракції ліпідних компонентів. Крім того, вибір гексану мотивувався тим, що як і экстрагент він характеризується наступними властивостями: малою токсичністю, наданням консервуючої дії на біомолекули, протимікробною активністю, зручністю у використанні та економічністю.

Після відділення ліпідних компонентів супернатанта проводять просвітлюючу фільтрацію об’єму, що залишився безліпідної рідини, що призначена для видалення великих молекул, частинок мікроорганізмів, залишків фрагментів клітин. Потім проводиться так звана стерилізуюча фільтрація, необхідна для видалення мікроорганізмів, вірусних частинок і великих молекул для одержання лікувального засобу в максимально очищеному вигляді.

Отриманий фільтрат піддають заморожуванню за нормальної температури 28 – 30°С і ліофілізують.

Дуже ефективний препарат отримується з мозку, печінки та підшлункової залози, оскільки їх функціонування забезпечує значною мірою виживання новонароджених особин у перші години та добу постнатального періоду [11].

Вибір зазначених тканин та органів поросят як вихідної сировини пов'язаний з, насамперед, еволюційною близькістю цих тварин до організму людини, підвищеною здатністю до виживання новонароджених у ранньому післяпологовому періоді і великою сталістю до гіпоксії, а також народженням в потомстві великої кількості поросят, що дозволяє їх вибрати як донорів тканин. Під час пологів стрімко наростає гіпоксія, унаслідок чого в мітохондріях розвивається адаптаційна реакція, при якій продукуються і нагромаджуються ростові, трофічні і протекторні чинники, які надають мембраностабілізуючу і цитопротекторну дію, яка лежить у основі нейро- і гепатопротекторного, і навіть антитоксичного ефекту за умов гострої гіпоксії.

Препарат Мітохондрин–2 містить спектр амінокислот, серед яких є домінуючі (глутамінова і аспарагінова кислоти, гліцин, аланін, серин, лейцин, валін), групу олігопептидів (молекулярна маса 2500 – 5000 Да) і поліпептидів (молекулярна маса до 7000 Да). Ці дані отримано з допомогою тестування різних фракцій з тканин та органів контрольних та досліджуваних тварин на біологічних моделях, описаних у прикладах, а також з допомогою амінокислотного аналізу [2, 30]. Отже, отриманий із вмісту мітохондрій засіб є складним амінокислотно – пептидним комплексом. Фармакологічно особливо активними чинниками, виділеними зі вмісту мітохондрій, є олігопептиди і пептиди з молекулярною масою в діапазоні 2500 – 7000 Да, а також і амінокислоти цього засобу.

Було проведено дослідження Мітохондрину–2 на осмотичну резистентність еритроцитів пацюків. Експеримент проводили на 18 статевозрілих білих пацюках, самцях Вістар з масою тіла 250-300 г. Для оцінки антигіпоксичної захисної дії пропонованого засобу використовували метод визначення осмотичної резистентності еритроцитів на моделі гемічної гіпоксії, викликаної гострим отруєнням нітробензолу [13, 23]. Були використані 3 групи пацюків: 1-ша група – інтактні тварини, 2-га – пацюки отруєні нітробензолом, в 3-й групі отруєним нітробензолом тваринам вводили запропонований препарат. Гемічну гіпоксію моделювали одноразовим внутрішньошлунковим введенням водного розчину нітробензолу в дозі 341 мг/кг маси тіла. Препарат розводили 0,9% розчином NaС1 і вводили тваринам внутрішньочеревно одноразово через 30 хв після отруєння нітробензолом в дозі 0,1 мг активної речовини на 1 кг маси тіла пацюків. Забір крові проводили з пахової вени через 3 год і сім діб після отруєння і визначали осмотичну резистентність еритроцитів. З метою визначення впливу запропонованого препарату на загальні метаболічні процеси реєстрували масу тіла, і температуру всіх експериментальних тварин.

Аналіз отриманих результатів щодо впливу запропонованого препарату на осмотичну резистентність еритроцитів пацюків свідчить про його позитивну дію на мембрани еритроцитів через 3 год після отруєння нітробензолом. У 0,45% розчині NаС1 гемоліз еритроцитів у тварин, яким вводили нітробензол, становив 33,1%, а яким вводили нітробензол і запропонований препарат – 14,7%) (р<0,05). У інтактних тварин гемоліз становив 12,9%. У 0,50% розчині NaС1 гемоліз еритроцитів у тварин, яким вводили нітробензол, становив 15,1%, а яким вводили нітробензол і запропонований препарат – 5,1 (р<0,05). У інтактних тварин в 0,50% розчині NаСl гемоліз становив 9,4%. Аналогічна закономірність була і через 7 діб.

Слід зазначити, що у пацюків, які отримували запропонований засіб, спостерігали відносно стабільну температуру тіла в межах видової норми в порівнянні з контрольною групою отруєних пацюків, у яких через 3 год після отруєння реєстрували падіння температури з 37,95 ± 0,12 до 34,55 ± 0,20°С (р<0,05).

Проведені досліди на дрібних лабораторних тваринах дозволяють зробити висновок про те, що даний засіб має виражену антигіпоксичну і антитоксичну активність при лікувальному і профілактичному застосуванні. Він здатний виявити виражену фармакологічну дію при різних захворюваннях, наприклад, при травматичній хворобі та інтоксикаціях на фоні гіпоксії в найгострішому й у гострому періодах її розвитку. Даний засіб може застосовуватися у пацієнтів різного віку, при захворюваннях пов’язаних із пошкодженням центральної нервової системи, серцево-судинної та інших систем організму, в основі яких лежить чітко виражені мітохондріальні дисфункції.

Раніше для вивчення антигіпоксичної і мембранопротекторної дії було створено Мітохондрин–1, який виділений із тканин новонароджених корів. Проведено дві серії експериментів. У першій серії вивчали антигіпоксичну дію Мітохондрину–1 з допомогою моделі гіпоксії – гіперкапнії, тоді як у другій серії - мембранопротекторну дію Мітохондрину–1 на моделі гемічної гіпоксії при нейротоксичному пошкодженні, що було викликано гострим отруєнням нітробензолом.

Дослідження проводили на статевозрілих лабораторних тваринах – самцях: безпородних білих пацюках з початковою масою тіла 250 – 300 г і мишах 17 – 20 г. Тварин після карантину (2 тиж.) утримували на стандартному харчовому раціоні віварію.

Для оцінки захисної дії препарату Мітохондрину– 1, як можливого мембраностабілізуючого засобу, використаний метод визначення осмотичної резистентності еритроцитів на моделі гемічної гіпоксії, викликаної гострим отруєнням нітробензолом [13, 19, 23]. В експериментах використовували 4 групи пацюків. 1-ша група складалася з інтактних тварин, 2-у становили пацюки, отруєні нітробензолом. У 3-й та 4-й групах для корекції гострого отруєння нітробензолом застосовували відповідно препарат для порівняння церебрал [4] та засіб Мітохондрин– 1.

Гемічну гіпоксію моделювали поодиноким введенням водного розчину нітробензолу, який готували з додаванням твін-85. Розчин вводили металевим зондом в шлунок у дозі 341 мг/кг маси тварини. Розчини церебралу і Мітохондрину-1 готували з використанням фізіологічного розчину і вводили тваринам внутрішньочеревно однократно через 30 хв після отруєння нітробензолом. Дози препаратів одинакові – 0,1 мг активної речовини на 1 кг маси пацюків.

Через 3 год і на 7-му добу після отруєння у тварин брали кров із пахової вени для визначення осмотичної резистентності еритроцитів. В пробірки з розчином NaCl різних концентрацій вносили по 0,1 мл крові і залишали на 24 год при температурі 22°С. Через добу всі проби центрифугували (3000 об/хв) протягом 30 хв з використанням центрифуги ЦЛК-1. Поглинання розчинів визначали на фотоелектроколориметрі КФК-2МП при довжині хвилі 450 нм в кюветі (10 мм).

У другій серії експериментів вивчали захисну дію Мітохондрину–1 на оригінальній моделі гіпоксиї-гіперкапнії. Мишей поміщували в одинакові гермокамери; враховуючи масу тварин, створювали одинакові об’єми повітря в кожній камері. В ході зкспериментів реєстрували початок виникнення судом і час смерті тварин.

Препарат Мітохондрин–1 вводили внутрішньочеревно в дозі 0,1 мг/кг. В 1-у експериментальну групу ввійшли тварини, яким внутрішньочеревно вводили 0,9% NaС1, мишам 2-ї и 3-ї групи вводили Мітохондрин–1 відповідно за 24 і 3 год до розміщення їх в гермокамерах. Мишам 4-ї группи в шлунок одноразово вводили препарат порівняння тазепам в дозі 10 мг/кг, через 3 год їх поміщали в гермокамери.

З метою визначення впливу М–1 на метаболічні процеси проводили реєстрацію приросту маси тіла і температурної депресії експериментальних тварин. Результати опрацьовували статистично з допомогою персонального комп’ютера, з визначенням критерія Стьюдента.

Оцінюючи протекторну дію Мітохондрину–1, як мембраностабілізуючого засобу, при визначенні осмотичної резистентності еритроцитів крові пацюків отримали наступні результати. В крові інтактних тварин при концентраціях розчину NaС1 0,25; 0,3 і 0,35% спостерігали повний гемоліз еритроцитів. При збільшенні концентрації NаСІ до 0,5% кількість гемолізуючих еритроцитів зменшилась і становила 9,8%. В контрольній групі тварин під дією нітробензолу (1/2 ЛД₅₀) через 3 год після затравки гемоліз 87,3% еритроцитів спостерігали в 0,35% розчині NаСІ, який поступово зменшувався із збільшенням концентрації NaС1 до 0,5%. При подальшому збільшенні концентрації NаСІ кількість гемолізованих еритроцитів була невеликою і практично не відрізнялася від показників у інтактних тварин. На фоні гемічної гіпоксії реєстрували незначний позитивний вплив церебралу на організм пацюків. При цьому незначно підвищувалась осмотична резистентність еритроцитів в порівнянні із показниками контрольної групи отруєних тварин. Так, в 0,4% розчині NaС1 спостерігався гемоліз 50,5%, а в 0,5% розчині NаСІ гемоліз 11,5% еритроцитів. Ці показники не відповідали таким в інтактній групі тварин. Яскравіше захисна дія церебралу проявилась на 7-у добу. Гемоліз зменшився із 13,6% до 7,5% в 0,45% розчині і більш ніж в два рази — із 38,7% до 17,8% — в 0,4% розчині NaС1 в порівнянні із показниками контрольної групи затравлених пацюків. Це свідчить про те, що під впливом церебралу в пізніші терміни отруєння суттєво підвищується клітинна резистентість, а місцем впливу церебралу є цитомембранні клітини, де відбувається активація ферментних систем антиоксидантного захисту [3].

Аналіз результатів по впливу Мітохондрину–1 на осмотичну резистентність еритроцитів свідчить про позитивну дію препарату на їх мембрани через З год після отруєння нітробензолом. Відмічено зменшення гемолізу з 16% у контрольній групі отруєних тварин і 11,5% в групі із застосуванням церебралу до 5,6 % із застосуванням Мітохондрину-1 в 0,5% розчині NаС1, і навіть відповідно: з 32 і 22,7% до 14,7% із застосуванням Мітохондрину–1 в 0,45% розчині NаС1. На 7-му добу спостереження зменшення гемолізу еритроцитів у цій групі тварин не зареєстровано.

Оцінюючи вплив Мітохондрину–1 на загальні метаболічні процеси в організмі пацюків слід відмітити, що, як на початку (3 год), так і у кінці дослідження (7 діб) у тварин, яким вводили Мітохондрин–1, зафіксована стабільна температура тіла не більше норми. На 7-му добу спостереження зазначено незначне зменшення маси тіла. У той самий час у отруєних нітробензолом тварин зафіксовано зменшення маси тіла в порівнянні з вихідними даними, тоді як в пацюків із застосуванням церебралу спостерігався приріст маси тіла (на 6,5 г; р < 0,05) в порівнянні з вихідними даними. Що ж до температурної депресії у цій групі тварин, то через 3 год після отруєння зафіксовано падіння температури до (35,05 ± 0,24)°С. На 7-му добу спостереження температура пацюків нормалізувалася.

Усе свідчить про те, що при гемічній формі гіпоксії, викликаної введенням нітробензолу, захисна дія церебралу проявляється у пізніший період, що відображалось в підвищенні осмотичної резистентності еритроцитів крові, збільшенні маси тіла тварин і нормалізації температурного гомеостазу на 7-му добу спостережень. Захисні властивості Мітохондрину–1 виявлялися у ранній період після отруєння, що супроводжувалося підвищенням осмотичної резистентності еритроцитів крові, стабільної нормальної температури тіла, і незначним зниженням маси тварин.

Вивчення захисної дії Мітохондрину–1 на моделі гіпоксії - гіперкапнії показало, що препарат збільшує тривалість життя мишей в гермокамерах. При профілактичному одноразовому веденні Мітохондрину–1 за 3 год перед розміщенням їх в камери спостерігалося зростання тривалості життя тварин на 19% в порівнянні з контролем, а у тварин, яким Мітохондрин–1 вводили за добу до розміщення у камерах, реєстрували збільшення тривалості життя на 5,3% у порівнянні з контролем. Це свідчить про активацію компенсаторних антигіпоксичних механізмів мишей у перші години після введення препарату. У зв'язку з цим, Мітохондрин–1 можна охарактеризувати як антигіпоксант ендогенного походження із малим латентним періодом дії, що є його найхарактернішою фармакологічною особливістю.

Захисну дію тазепаму у цій серії досліджень було яскраво виражено і проявилося в тому, що час до настання судом у експериментальних мишей, поміщених у гермокамери, при його профілактичному введенні збільшувалося на 96%, а тривалість життя мишей за умов гіпоксії - гіперкапнії збільшувалася на 89,8% в порівнянні з контрольними тваринами і 59,3% в порівнянні з групою тварин, яким вводили Мітохондрин–1 за 3 год до розміщення у гермокамери.

Аналізуючи вплив Мітохондрину–1 на метаболічні процеси у мишей, треба сказати, що спочатку (1 год) й під кінець спостережень (1 доба) у тварин, яким вводили Мітохондрин–1, фіксувалася стабільна температура тіла у межах видової норми, не спостерігалось зменшенням маси тварин через 2 год після введення Мітохондрину-1, особливо у перші ж години після його введення.

Отже, встановлено, що Мітохондрин–1, отриманий із мозку новонароджених кролів володіє антигіпоксичною активністю, його ефект проявляється при гіпоксично-гіперкапічних і немічних формах гіпоксії. Дія препарату більш виражена через 3 год, ніж через добу після застосування. Антигіпоксична активність пов’язана з його цитомембранною нейропротекторною дією [1, 30].

Таким чином, аналізуючи досліди на дрібних лабораторних тваринах, можна зробити висновок, що препарати Мітохондрин–1 та Мітохондрин–2 володіють вираженою антигіпоксичною і антитоксичною активністю при лікувальному і профілактичному застосуванні. Відрізняються між собою препарати тільки тканинами тварин взятих на їх виготовлення. Для отримання препарату Мітохондрин–1 використвували тканини новонароджених кролів, а для Мітохондрину–2 – поросят.