8. Самовоспроизведение генетического материала. Репликация. Репликон. Особенности репликации у про и эукариот.
Одним из основных свойств материала наследственности является его способность к самокопированию —репликация. Это свойство обеспечивается особенностями химической организации молекулы ДНК, состоящей из двух комплементарных цепей. В процессе репликации на каждой полинуклеотидной цепи материнской молекулы ДНК синтезируется комплементарная ей цепь. В итоге из одной двойной спирали ДНК образуются две идентичные двойные спирали. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, называют полуконсервативным. Для осуществления репликации цепи материнской ДНК должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами, на которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних молекул.
Инициация репликации осуществляется в особых участках ДНК, обозначаемых ori (от англ. origin —начало). Они включают последовательность, состоящую из 300 нуклеотидных пар, узнаваемую специфическими белками. Двойная спираль ДНК в этих локусах разделяется на две цепи, при этом, как правило, по обе стороны от точки начала репликации образуются области расхождения полинуклеотидных цепей — репликацчонные вилки, которые движутся в противоположных от локуса ori направлениях. Между репликационными вилками образуется структура, называемая репликаци-онным глазком, где на двух цепях материнской ДНК образуются новые полинуклеотидные цепи. С помощью ферментагеликазы, разрывающего водородные связи, двойная спираль ДНК расплетается в точках начала репликации. Образующиеся при этом одинарные цепи ДНК связываются специальными дестабилизирующими белками, которые растягивают остовы цепей, делая их азотистые основания доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами, находящимися в нуклеоплазме. На каждой из цепей, образующихся в области репликационной вилки, при участии фермента ДНК-полимеразы осуществляется синтез комплементарных цепей. В процессе синтеза репликационные вилки движутся вдоль материнской спирали в противоположных направлениях, захватывая все новые зоны. Разделение спирально закрученных цепей родительской ДНК ферментом геликазой вызывает появление супервитков перед репликационной вилкой. Это объясняется тем, что при расхождении каждых 10 пар нуклеотидов, образующих один виток спирали, родительская ДНК должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для продвижения репликационной вилки вся молекула ДНК перед ней должна была бы быстро вращаться, что потребовало бы большой затраты энергии. В действительности это не наблюдается благодаря особому классу белков, называемых ДНКтопоизомеразами. Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК, что дает ей возможность вращаться вокруг второй цепи. Это ослабляет накопившееся напряжение в двойной спирали ДНК. К высвобождающимся водородным связям нуклеотидных последовательностей разделенных родительских цепей присоединяются свободные нуклеотиды из нуклеоплазмы, где они присутствуют в виде дезоксирибонуклеозидгрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Комплементарный нуклеозидтрифосфат образует водородные связи с определенным основанием материнской цепи ДНК. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы он связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синтезируемой цепи, отдавая при этом неорганический пирофосфат. Поскольку ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе в 3'-положении предшествующего нуклеотида, цепь постепенно удлиняется на ее 3'- конце. Особенностью ДНК-полимеразы является ее неспособность начать синтез новой полинуклеотидной цепи путем простого связывания двух нуклеозидтрифосфатов: необходим 3'-ОН-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза может лишь добавлять новые нуклеотиды. Такую полинуклеотиднуй цепь называют затравкой или праймером. Роль затравки для синтеза полинуклеотидных цепей ДНК в ходе репликации выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участии фермента РНК-праймазы. Указанная особенность ДНК-полимеразы означает, что матрицей при репликации может служить лишь цепь ДНК, несущая спаренную с ней затравку, которая имеет свободный 3'-ОН-конец. Способность ДНК-полимеразы осуществлять сборку полинуклеотида в направлении от 5'- к 3' -концу при антипараллельном соединении двух цепей ДНК означает, что процесс репликации должен протекать на них по-разному. Действительно, если на одной из матриц (3' → 5') сборка новой цепи происходит непрерывно от 5'- к 3'-концу и она постепенно удлиняется на 3'-конце, то другая цепь, синтезируемая на матрице (5' → 3'), должна была бы расти от 3'- к 5'-концу. Это противоречит направлению действия фермента ДНК-полимеразы. В настоящее время установлено, что синтез второй цепи ДНК осуществляется короткими фрагментами (фрагменты Оказаки) также в направлении от 5'- к 3'- концу (по типу шитья «назад иголкой»). У эукариот фрагменты Оказаки значительно короче (от 100 до 200 нуклеотидов). Синтезу каждого такого фрагмента предшествует образование РНК-затравки длиной около 10 нуклеотидов. Вновь образованный фрагмент с помощью фермента ДНК-лигазы соединяется с предшествующим фрагментом после удаления его РНКзатравки.
В связи с указанными особенностями репликационная вилка является асимметричной. Из двух синтезируемых дочерних цепей одна строится непрерывно, ее синтез идет быстрее и эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идет медленнее, так как она собирается из отдельных фрагментов,требующих образования, а затем удаления РНК-затравки. Поэтому такую цепь называют запаздывающей (отстающей). Хотя отдельные фрагменты образуются в направлении 5' → 3', в целом эта цепь растет в направлении 3' → 5'. В виду того, что от локуса ori как правило начинаются две репликационные вилки, идущие в противоположных направлениях, синтез лидирующих цепей в них идет на разных цепях материнской ДНК. Конечным результатом процесса репликации является образование двух молекул ДНК, нуклеотидная последовательность которых идентична таковой в материнской двойной спирали ДНК. Рассмотренная последовательность событий, происходящих в ходе репликативного синтеза, предполагает участие целой системы ферментов: геликазы, топоизомеразы, дестабилизирующих белков, ДНК-полимеразы и других, совместно действующих в области репликационной вилки. Репликация ДНК у про-и эукариот в основных чертах протекает сходно, однако, скорость синтеза у эукариот (около 100 нуклеотидов/с) на порядок ниже, чем у прокариот (1000 нуклеотидов/с). Причиной этого может быть образование ДНК эукариот достаточно прочных соединений с белками, что затрудняет ее деспирали-зацию, необходимую для осуществления репликативного синтеза. Фрагмент ДНК от точки начала репликации до точки ее окончания образует единицу репликации — репликон. Однажды начавшись в точке начала (локус on), репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток имеют один локус on и представляют собой целиком отдельные репликоны. Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. В связи с этим удвоение молекулы ДНК, расположенной вдоль эукариотической хромосомы, начинается в нескольких точках. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.
9 Уровни организации ген.материала.Генный уровень организации наследственного материала. Ген. Определение и классиф. Строение генов про-и эукариот. Свойства гена. Понятие о генном балансе и дозе гена. Особенности инактивации Х-хромосомы у чел. Тельце Барра. Диагностическое значение исследования Х-полового хроматина
Ответ Известны 3 уровня организации наследственного материала: молекулярный, хроматиновый (хромосомный) и популяционный. 1-й уровень -молекулярный. Нативная структура ДНК представлена в виде двойной спирали, описанной впервые Уотсоном и Криком в 1953 г Молекулярный уровень организации, составляющий предмет молекулярной биологии, предполагает изучение строения белков, их функций, роль нуклеиновых кислот в хранении и реализации генетической информации, процессов синтеза биологически важных соединений. На молекулярном уровне организации ведутся основные исследования по биотехнологии и генной инженерии, поскольку многие свойства организма определяются именно этим уровнем. 2-й уровень-Хромосомный уровень организации наследственного материала характеризуется особенностями морфологии и функций хромосом. Геном -совокупность всех генов гаплоидного набора хромосом данного вида организма. Геномный уровень организации наследственного материалаимеет особенности у прокариот и эукариот. Генный уровень представлен совокупностью генов -элементарных единиц. Уровни организации наследственного материала Все наблюдаемое разнообразие рассмотренных типов наследования признаков объясняется тем, что в клетках организмов имеются отдельные гены, которые объединены в группы сцепления, или хромосомы. В совокупности хромосом заключено все многообразие генов организма (клетки) , которые вступают в разные виды взаимодействия друг с другом. Соответственно этому наследственной структуре организмов (клеток) можно выделить как бы три уровня организации: генный, хромосомный и геномный. Наследственный материал любой клетки (организма) дискретен, т. е. представлен отдельными функциональными единицами — генами. Каждый ген отвечает за развитие отдельного признака. Число генов, заключенных в наследственном материале, велико. Закономерность передачи всего генетического материала из поколения в поколение достигается благодаря тому, что отдельные гены существуют не разрозненно, а собраны в хромосомы, с которыми происходят строго определенные превращения в процессе размножения клеток и организмов. Поддержание постоянной структуры хромосом в ряду поколений свидетельствует о большом значении этого уровня организации материала наследственности. Хромосомный уровень организации наследственного материала присущ всем эукариотическим организмам. У прокариот основная масса генов сосредоточена в единственной кольцевидной хромосоме, которая по своему внутреннему строению отличается от хромосом эукариот. Все хромосомы клетки (организма) объединены в набор — кариотип, поддержание постоянства которого обеспечивается митозом для клеток и мейозом с последующим оплодотворением для организмов, размножающихся половым путем. При половом размножении каждый родитель передает новому поколению в своих гаметах полный одинарный набор всех генов — геном. Объединение геномов родительских гамет при оплодотворении создает геномный уровень организации наследственного материала, который соответствует генотипу организма (клеткиаследственности и изменчивости.
3-й уровень-на уровне популяции абиотические факторы воздействуют на такие параметры, как рождаемость, смертность, средняя продолжительность жизни особи, скорость роста популяции и ее размеры, нередко являясь важнейшими причинами, определяющими характер динамики численности популяции и пространственное распределение особей в ней. Популяция может приспосабливаться к изменениям абиотических факторов, во-первых, меняя характер своего пространственного распределения и, во-вторых, путем адаптивной эволюции. Избирательное отношение животных и растений кфакторам средыпорождает избирательность и к местообитаниям, т. е, экологическую специализацию по отноше-нию к участкам ареала вида, которые он пытается занять и заселить. Участок ареала, занятый популяцией вида и характеризующийся определенными экологическими условиями, называется стацией. Выбор стации, как правило, определяется каким-нибудь одним фактором; это может быть кислотность, соленость, влажность и т. д. Структура гена. Гены включают в себя такие единицы:
Мутоны – минимально одна пара нуклеотидов, способных мутировать.
Реконы – минимально две пары нуклеотидов, способных рекомбинировать (меняются местами между собой).
Цистрон (ген) – функциональное название гена. Содержат десятки сотен пар нуклеотидов, контролирующих синтез полипептидов. Химическое строение гена.
Ген – участок молекулы ДНК, состоящий из последовательности нуклеотидов, являющихся мономером ДНК, либо РНК. Нуклеотид – сложное органическое соединение, состоящее из: а) азотистых оснований пуринового (аденин, гуанин), б) пиримидинового (тимин, урацил, цитозин) ряда, б) остатков фосфорной кислоты. Классификация генов по функциям:
I. Структурные. Они транскрибируются и определяют структуру:
и-РНК и следовательно структурных белков
и-РНК и следовательно белков-ферментов
р-РНК
т-РНК. Для прокариот характерна относительно простая структура генов. Так, структурный ген бактерии, фага или вируса, как правило, контролирует одну ферментативную реакцию. Специфичным для прокариот является оперонная система организации нескольких генов. Гены одного оперона (участка генетического материала, состоящего из 1, 2 и более сцепленных структурных генов, которые кодируют белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита; в оперон эукариот входит, как правило, 1 структурный ген; оперон содержит регуляторные элементы) расположены в кольцевой хромосоме бактерии рядом и контролируют ферменты, осуществляющие последовательные или близкие реакции синтеза (лактозный, гистидиновый и др. опероны). Все гены организма можно разделить на две большие группы: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные гены постоянно включены: они функционируют на всех стадиях онтогенеза и во всех тканях. К конститутивным относятся гены, кодирующие тРНК, рРНК, ДНКполимеразы, РНК-полимеразы, белки-гистоны, белки рибосом и т.д. Иначе говоря, это «гены домашнего хозяйства», или существенные гены без которых клетки не могут существовать.
Геном эукариот: общие сведения"В отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле) , получившем название ядра, а значительно меньшая часть -в митохондриях, хлоропластах и других пластидах.Так же, как и у прокариот, информационной макромолекулой генома эукариот является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. ДНК-белковые комплексы эукариот получили название хроматина . На протяжении клеточного цикла хроматин претерпевает высокоупорядоченные структурные преобразования в виде последовательных конденсаций-деконденсаций. В соматических клетках при максимальной конденсации в метафазе митоза эти преобразования сопровождаются формированием метафазных хромосом . Морфология и число метафазных хромосом являются уникальными характеристиками вида... « 1 Ген дискретен в своем действии, т. е. обособлен в своей активности от других генов. 2 Ген специфичен в своем проявлении, т. е. отвечает за строго определенный признак или свойство организма. 3 Ген может действовать градуально, т. е. усиливать степень проявления признака при увеличении числа доминантных аллелей (дозы гена ). 4 Один ген может влиять на развитие разных признаков — это множественное, или плейотропное, действие гена . 5 Разные гены могут оказывать одинаковое действие на развитие одного и того же признака (часто количественных признаков ) — это множественные гены, или полигены. 6 Ген может взаимодействовать с другими генами, что приводит к появлению новых признаков . Такое взаимодействие осуществляется опосредованно — через синтезированные под их контролем продукты своих реакций. 7 Действие гена может быть модифицировано изменением его местоположения в хромосоме (эффект положения) или воздействием различных факторов внешней среды
Ген – это элементарная единица наследственности, участок молекулы ДНК, определенный локус хромосомы. Один ген кодирует одну полипептидную цепь, тем самым определяя развитие признака. В диплоидном наборе соматических клеток эукариот содержатся 2 гомологичные хромосомы и соответственно 2 гена, определяющие развитие какого-либо одного признака. Генный баланс-Механизм определения пола, первоначально обнаруженный у дрозофил, согласно которому пол особи зависит от отношения числа Х-хромосом к числу наборов аутосом (А), в соответстсии с этим у самцов отношение Х/А меньше или равно 0.5, у самок -больше или равно 1.0, а у интерсексов <intersex> -0.5<X/A<1.0. Доза гена- Kоличество копий данного гена в расчете на ядро одной клетки; в норме Д.г. равна уровню плоидности<ploidy>, а точнее, равна числу гомологичных хромосом, на которых данный ген локализован, -при этом Д.г.может быть выше уровня плоидности (трисомия <trisomy> ит.п.) или ниже (половые хромосомы у гетерогаметного пола, моносомия <monosomy> Инактивация X-хромосомы
ДНК человека упакована в 23 парыхромосом разного размера. Одна хромосома из каждой пары унаследована от наших отцов (отцовский гомолог), а другая -от наших матерей (материнский гомолог). Двадцать две пары, в совокупности называемые аутосомами и пронумерованные числами 1-22 в порядке убывающей величины, одинаковы у самцов и самок, тогда как одна пара, половые хромосомы, различается между полами. Самки обладают двумя копиями хромосомы среднего размера, обозначаемой как Х-хромосома, в то время как самцы имеют одну Х-хромосому и одну копию более мелкой, бедной генами хромосомы, обозначаемойY. У самцов Х-хромосома всегда наследуется от матери, aY-хромосома -от отца, тогда как у самок одна Х-хромосома -материнская (Хm), а другая -отцовская (Хр). Это хромосомное различие между полами является обычным у млекопитающих и многих других организмов и представляет собой часть биологического механизма, посредством которого определяется пол. Однако для организма это связано с рядом эволюционных проблем, в том отношении, что два пола различаются по числу сцепленных с X генов, которые они имеют; самки обладают вдвое большим их количеством, чем самцы. Это может приводить к дисбалансу в количестве генных продуктов (РНК и белков), который, в свою очередь, требовал бы различий в контроле метаболизма и других клеточных процессов. Чтобы избежать этого, возникли механизмы компенсации дозы генов , уравновешивающие уровни продуктов сцепленных с X генов у обоих полов. У млекопитающих механизм компенсации дозы связан с выключением (сайленсированием) большинства генов только на одной из двух Х-хромосом, так что у самок, как и у самцов, имеется только одна активная хромосома. Это радикальное решение, обычно называемое инактивацией Х-хромосомы, впервые было предложено в 1961 году Мэри Лайон для того чтобы объяснить паттерны экспрессии сцепленных с X генов окраски меха у мышей, сходные с паттерном окраски меха у кошки "calico". С тех пор более 40 лет интенсивных исследований было посвящено попыткам разобраться в этих интригующих и сложных механизмах, осуществляющих этот процесс. Мы знаем, что инактивация X происходит на ранних этапах развития, но сложным образом. Очень рано, когда эмбрион состоит всего лишь из нескольких клеток, отцовская Х-хромосома избирательно инактивируется во всех клетках. Хр должна быть как-то маркирована, "импринтирована" для инактивации. Позднее, на стадии бластоцисты (непосредственно перед имплантацией), когда зародыш состоит из 50-100 клеток, в тех клетках, которые в дальнейшем сформируют сам эмбрион (локализованных во внутренней клеточной массе [ ICM ]), Хр вновь активируется, так что, говоря коротко, у самок имеются две активные Х-хромосомы. Затем либо Хр, либо Хm случайно выбирается для инактивации, и гены на ней сайленсируются. Любопытно, что в тех клетках бластоцисты, которые в дальнейшем формируют экстраэмбриональные ткани (плаценту и желточный мешок), Хр остается "молчащей". Вопрос о том, каким образом для инактивации "выбирается" одна из X в ICM, остается пока что без ответа. Х-хромосома, выбранная для инактивации, остается "молчащей" на протяжении всех последующих клеточных генераций. Это одна из наиболее стабильных форм сайленсинга генов, которая нам известна, и попытки экспериментально добиться ее реверсии неизменно оказывались безуспешными. Однако ооциты (женские зародышевые клетки) способны ревертировать этот процесс инактивации, так что они обладают двумя активными X в мейозе, и единственная Х-хромосома в зрелом, гаплоидномяйце также активна. Исследования процесса инактивации X выявили новые молекулярные механизмы сайленсинга генов . Инициацию сайленсинга вызывает повышенная экспрессия некодирующей РНК, транскрибируемой с гена, обозначенного XIST, содной только из двух женских Х-хромосом. Эта РНК покрывает Х-хромосому, содержащую ген XIST , которая включается, что выглядит как участок зеленой окраски на фотографии клеточного ядра. Этим далее инициируется сайленсинг генов по всей этой хромосоме. Сам XIST остается включенным. После покрытия XIST неактивная, "молчащая" X претерпевает ряд изменений. Главные белки, упаковывающие ДНК, гистоны, подвергаются химическим модификациям в функционально важных сайтах. Например, уровни ацетилирования избранных остатков лизина катастрофически падают, тогда как метилирование других лизинов увеличивается. Вслед за этими изменениями происходит метилирование избранных участков на неактивной Х-хромосоме, Xi, - процесс, часто связанный с долговременным сайленсингом генов. Все эти и другие изменения придают неактивной Х-хромосоме очень характерную структуру, которая нередко описывается как конденсированная и которая видна в клеточном ядре как отчетливая глыбка плотной ДНК, известная как тельце Бара . На протяжении последних лет исследования инактивации Х-хромосомы позволили проникнуть в фундаментальные эпигенетические механизмы сайленсинга генов и в то, каким образом паттерны экспрессии генов регулируются в ходе развития. Можно с уверенностью предсказать, что так будет и дальше. Тельце Барра -структура, которая нередко описывается как конденсированная и которая видна в клеточном ядре как отчетливая глыбка плотной ДНК Тельце Барра (X-половой хроматин) — свёрнутая в пло́тную (гетерохроматиновую) структуру неактивная X-хромосома, наблюдаемая в интерфазных ядрах соматических клеток самок плацентарных млекопитающих, включая человека. Хорошо прокрашивается осно́вными красителями. Из двух X-хромосом генома любая в началеэмбрионального развития может инактивироваться, выбор осуществляется случайно. У мыши исключением являются клетки зародышевых оболочек, также образующихся из ткани зародыша, в которых инактивируется исключительно отцовская X-хромосома[2]. Таким образом, у самки млекопитающего, гетерозиготной по какому-либо признаку, определяемому геном X-хромосомы, в разных клетках работают разные аллели этого гена (мозаицизм). Классическим видимым примером такого мозаицизма является окраска черепаховых кошек — в половине клеток активна X-хромосома с «рыжим», а в половине — с «чёрным» аллелем гена, участвующего в формировании меланина. Коты черепаховой окраски встречаются крайне редко и имеют две X-хромосомы (анеуплоидия). У людей и животных с анеуплоидией, имеющих в геноме 3 и более X-хромосом (см., напр., синдром Клайнфельтера), число телец Барра в ядре соматической клетки на единицу меньше числа X-хромосом Цитогенетические методы исследования Цитогенетические методы исследования включают изучение полового хроматина, хроматина нейтрофилов периферической крови, анализ кариотипа (исследование хромосомного набора). Половой хроматин в норме наблюдается лишь у женщин, у мужчин он отсутствует или определяется в единичных ядрах.
Половой хроматин, обнаруживаемый в ядрах клеток у женщин, образуется одной, неактивной, Х-хромосомой (другая Х-хромосома в клетках женского организма является активной). У мужчин имеется лишь одна Х-хромосома, и она всегда активна, поэтому в ядрах клеток мужского организма половой хроматин не определяется.
Исследование полового хроматина имеет большое диагностические значение, прежде всего при нерасхождениях половых хромосом в процессе спермато-или овогенеза.
В норме каждая женская половая клеткасодержит 22 аутосомы и одну Х-хромосому, мужская клетка, помимо 22 аутосом, содержит одну Х-хромосому илиY-хромосому, так как в процессе мейоза сперматоцит или овоцит делят свой хромосомный набор пополам, отдавая дочерним клеткам половину из 44 аутосом и одну из половых хромосом.
При нарушении мейоза может наступить нерасхождение половых хромосом. В результате в части сперматозоидов содержатся обе половые хромосомы (XY), а в других – нет ни одной, при нарушенном овогенезе в половине яйцеклеток имеются две Х-хромосомы, а в другой половине – ни одной.
При встрече аномальных яйцеклеток с нормальными сперматозоидами или аномальных сперматозоидов с нормальными клетками возможны 4 варианта: XXX (синдром трисомии X – возникает при встрече яйцеклетки XX со сперматозоидом X);
ХО (синдром Шерешевского – Тернера – возникает при встрече яйцеклетки О со сперматозоидом X или сперматозоида О с яйцеклеткой X); YO (встреча сперматозоидаY с яйцеклеткой О);
XXY (синдром Клайнфелтера – возникает при встрече сперматозоидаY с яйцеклеткой XX или сперматозоида XY с яйцеклеткой X).