Классификация по принципу фракционирования

В любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми распределяются молекулы фракционируемой смоси веществ. Под основным принципом фракционирования будем подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего такое распределение.

Адсорбционная хроматография

В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливается независимо для каждого компонента смеси веществ. Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чем большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюентом вдоль колонки или пластинки. Если сорбция происходит на наружной поверхности сплошных гранул, то имеет место адсорбционная хроматография в чистом виде. Если же материал сорбента имеет пористую структуру и большая часть сорбирующей поверхности находится внутри его гранул, то в задержании молекул вещества в неподвижной фазе участвует еще и процесс их диффузии в неподвижной жидкости внутри пор, подобно тому как это имеет место при гельфильтрации. Практически, впрочем, связывание вещества за счет сорбции доминирует.

Аффинная хроматография

Относительно слабое обратимое взаимодействие между молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом, ферментом и ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент различных соединений, которые представляют собой конкурирующие молекулы или буферные системы, изменяющие рН (см. рисунок).

В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, использующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же аффинному сорбенту.

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугиро­вания и декантации.

Также возможен несколько иной вариант аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис. 3).