5. Белоктарды бөліп алу, тазарту әдістерінің схемасын келтіріп, түсініктемесін жазыңыз.

Барлық белокты бірдей бөліп алатындай әдіс жоқ. Белоктардың биологиялық қызметін, құрылымын зерттеу үшін және оларға рентгендік құрылымдық талдау жасау үшін 100 мг ғана белок жеткілікті.

Белокты бөліп алу үшін ең алдымен оған аммоний сульфатымен, этанолмен немесе ацетонмен әсер етіп, қан сарысуынан глобулин белогын тұнбаға шөктіреді, бұл кезде басқа белоктар ерітіндіде қалады. Белоктарды бір-бірінен осындай қарапайым жолмен ажыратып бөледі. Ары қарай хроматография, электрофорез, изоэлектрофокустау сияқты әдістер бойынша жүргізіледі:

Материалды ұсақтау + құм, шыны + буфер ерітіндісі → центрифугалау → экстрактты бөліп алу + (NH₄)₂SO₄ + центрифугалау → тұнба + буфер → диализ → гель-фильтрация (сефадекс).

Хроматографиялық әдісі қоспалардың адсорбция және десорбция кезектесуіне негізделген. Хромотографиялық адсорбция, ажырататын бөлгіш, ион алмасатын және гель-сүзгіш сияқты түрлері бар. Әдістің шарты – бөліп ажырататын заттарды әртүрлі екі компонентті жүйеге қозғалмалы және қозғалмайтын фазаларға орналастырады. Белоктарды ажыратып бөлу үшін бағаналық хромотографияны пайдаланады. Ол үшін ерітіндідегі белоктар қоспасын шыны бағана арқылы өткізеді.

Гель-сүзгі әдісі бойынша хромотографиялау әдісі ДЭАЭ-сефадекстің (полисахарид) әртүрлі маркаларымен жүреді. Мұндай сүзгіден белоктардың өту жылдамдығы олардың молекуласы шамасына байланысты. Гель-сүзгі молекулалық елек сияқты. Шағын молекулалы белоктар бағана арқылы өту кезінде сефадекс түйіршіктерінің ішіне енеді, ал ірілері түйіршіктердің аралығында жүреді. Осыған байланысты ірі молекулалы белоктар бағана арқылы тезірек өтеді де, бірінші болып шығады.

Аффиндік хроматография – белоктың белгілі бір химиялық заттар тобымен байланысы алатын өзіне ғана тән қасиетіне негізделген. Мысалы, белгілі бір белок глюкозаға жақын дейік. Сонда глюкозаны қатты стационар фазамен ковалентті түрде, мысалы сефарозамен байланыстырады. Гель-сүзгі жағдайы кезіндегі сияқты, бұл фазамен хромотографиялық бағананы толықтырады. Бұдан кейін бағана арқылы белоктар қоспасының ерітіндісін өткізеді. Бағанадағы иммоблизацияланған глюкозада осы белок қана ұсталып қалады, себебі глюкозамен туыстас. Ал басқа белоктар адсорбцияланбайды, оларды буферлік ерітінді ілестіріп алып кетеді. Осыдан кейін байланысқан белокты глюкозаның концентрациялы ерітіндісінің көмегімен бағанадан бөліп алады.

Изоэлектрлік фокустеу – белокты заттардың өте күрделі қоспаларын электрофорездік жолмен бөлудің жетілдірілген әдісі. Бұл әдіс қоршаған ортаның рН шамасына байланысты белок молекулалары зарядының өзгеруіне негізделген. Изоэлектрлік нүктеге жеткен кезде белок молекуласы зарядтарының саны нольге тең болатыны және бұл кезде электр өрістерінің әсерінен оның қозғала алмайтындығы белгілі.

Изоэлектрлік фокустеу барысында шыны бағананы полиакриламидтік гельмен толтырғанда ерекше буфердің әсерімен рН градиенті қалыптасады. Осыдан кейін гельдің үстіне белок қоспаларының ерітіндісі құйылады. Бұл кезде электр өрістерінің әсерінен әр белок өзінің изоэлектрлік нүктесіне сәйкес келетін рН градиенті аймағына ауысады да, сонда қозғалысын тоқтатып, қалып қояды. Осылайша белоктар қоспасы изоэлектрлік нүктесіне байланысты бөлініп, гель бағанасы бойына орналасады. Сөйтіп әр белок өзіне тиісті тар алқапта рН көрсеткіші бойынша шоғырланып орналасады. Осылайша бөлінген топтарын коллекторға жинақтайды да, рН көрсеткіші бойынша ажыратып алады.