Масло

Белок

Открытая кольцевая и линейная днк Замкнутая кольцевая ллазмидная днк

Осадок РНК

**' * Г * 1 "д / I ! i' ^.7

£?■■■.■ ■■■■■■■■■■•'"У-.-.'--.'-.-:

• * *

■■ /:’■*»'* ■ 1 /.

Рис. 3.3.

Нижняя полоса — кольцевая ковалентно замкнутая плазмидная ДНК (рис. 3.3).

6. Снимите с пробирки крышку. Соберите материал нижней полосы ДНК в стеклянную пробирку с помощью иглы № 21 для подкожных инъекций, проколов ею сбоку стенку пробирки, как это описано на е. 94.

7. Удалите бромистый этидий следующим образом:

а) добавьте равный объем 1-бутанола, насыщенного во­дой, или изоамилового спирта;

б) энергичным пипетированием смешайте обе фазы;

в) отцентрифугируйте при 1500 g в течение 3 мин при ком­натной температуре;

г) перенесите нижнюю водную фазу в чистую стеклянную пробирку;

д) повторите экстракцию 4—6 раз, пока не исчезнет розо­вая окраска у водной фазы.

8. Проведите диализ водной фазы против нескольких смен буфера ТЕ (pH 8,0).

УДАЛЕНИЕ РНК ИЗ ПРЕПАРАТОВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Для некоторых целей (например, для расщепления рестрик- тазой Ва131 или для мечения б'-концов рестрикционных фраг­ментов плазмидной ДНК с помощью полинуклеотидкиназы) не­обходимы препараты ДНК, не содержащие примеси низкомоле­кулярной РНК. Хотя по массе такая примесь составляет неболь­шую часть препарата плазмидной ДНК, полученного с помощью

равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием, число молекул низкомолекулярной РНК может быть относительно велико и 5'-концы этих молекул могут составлять значительную часть всех 5'-концов, образующихся после обработки препарата рестриктирующей эндонуклеазой.

РНК удаляют из препаратов плазмиды любым из следующих способов.

Центрифугирование в 1 М NaCl¹

1. Измерьте объем раствора ДНК. Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия, pH 5,2, а затем 2 объема этанола. Хорошо пере­мешайте и поместите на холод (—20°С).

2. Соберите ДНК центрифугированием. Слейте этанол и вы­сушите осадок ДНК, поместив пробирки на короткое время в вакуумный испаритель.

3. Растворите ДНК в буфере ТЕ, pH 8,0, в концентрации не ниже 100 мкг/мл.

4. Добавьте РНКазу, свободную от ДНКазы (с. 397), до ко­нечной концентрации 10 мкг/мл. Проинкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.

5. В центрифужную пробирку от ротора Beckman SW50.1 (или аналогичного ему) налейте 4 мл раствора 1 М NaCl+TE. Поверх раствора 1 М NaCl наслоите 1 мл обработанной РНКазой плазмидной ДНК. Если останется место, заполните пробирку доверху буфером ТЕ. Отцентрифугируйте 6 ч при 40 000 об/мин при 20 °С в роторе Beckman SW50.1. Плазмидная ДНК осядет на дно пробирки, в то время как рибонуклеотиды останутся в надосадочной жидкости,

6. Слейте надосадочную жидкость. Растворите осадок плаз­мидной ДНК в желаемом объеме ТЕ.

Хроматография на биогеле А-150²

1. Обработайте препарат плазмидной ДНК РНКазой, как это описано выше (этапы 1—4).

2. Проведите одну экстракцию равным объемом уравнове­шенного буфером фенола.

3. Наслоите 1 мл водной фазы на колонку с биогелем А-150 (1 смХЮ см), уравновешенным буфером ТЕ, pH 8,0, с 0>1%-ным SDS.

4. Нанесите ДНК на колонку; подсоедините к колонке ре­зервуар с ТЕ + 0,1°/о-ный SDS и сразу же начинайте собирать фракции объемом по 0,5 мл.

¹ В. Seed, неопубликованные данные.

² Модификация процедуры, разработанной ДеНото и Гудмэном (F. De Noto, Н. Goodman, неопубликованные данные).

5. После сбора 15 фракций перекройте выход из колонки. Чтобы определить, в каких фракциях содержится плазмидная ДНК, проанализируйте по 10 мкл каждой фракции с помощью электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле или по флуоресцен­ции бромистого этидия (см. Приложение А).

6. Слейте вместе те фракции, которые содержат плазмидную ДНК. Осадите ДНК этанолом, как это было сделано на этапах 1—3,

Примечание. Удалить из колонки с биогелем А-150 всю плаз­мидную ДНК очень трудно. Чтобы исключить возможность за­грязнения, используйте колонку лишь один раз.

ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ

Рестриктирующие эндонуклеазы (или рестриктазы) — это ферменты, «узнающие» определенные последовательно­сти (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК и расщеп­ляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Их выделяют пре­имущественно из прокариотических клеток. Рестриктазы можно разделить на три группы. Ферменты типа I и ти­па III обладают модифицирующей (метилирующей) актив­ностью и ATP-зависимой рестриктирующей активностью (внесение разрывов), проявляемыми одним и тем же бел­ком. Ферменты обоих типов узнают неметилированные по­следовательности в ДНК-субстрате, но ферменты типа I вносят случайные разрывы, в то время как ферменты ти­па III разрезают ДНК в специфических участках.

Системы рестрикции — модификации типа II включают два отдельных фермента; рестриктирующую эндонуклеазу и модифицирующую метилазу. Бы1ло выделено большое число ферментов рестрикции типа II (Roberts, 1982), многие из которых используются в молекулярном клонировании. Эти ферменты разрезают ДНК внутри или около своих сайтов, которые обычно имеют 4—6 нуклеотидов и облада­ют осью симметрии 2-го порядка. Например, фермент £coRI узнает последовательность гексануклеотидов

5' з*

G-Д.Д-Т-Т-С

„С

Подобно многим другим ферментам рестрикции, £coRI вносит разрыв не точно по оси симметрии 2-го порядка, а в точках двух цепей ДНК, отстоящих друг от друга на че­тыре нуклеотида:

В результате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с выступающими липкими 5'-концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим концом, комплементарным ему. Таким образом любые молекулы ДНК, содержащие сайты рестрикции, можно соединять с другими молекулами и в результате получать рекомби­нантные молекулы.

Многие ферменты рестрикции, подобно £coRI, катали­зируют разрывы, в результате которых образуются фраг­менты ДНК с выступающими 5'-концами; под действием других (например, PstI)—с выступающими З'-липкими концами, в то время как третьи (например, Ball) разреза­ют ДНК по оси симметрии с образованием фрагментов с тупыми концами.

ИЗОШИЗОМЕРЫ

Обычно разные ферменты рестрикции узнают разные после­довательности (табл. 4.1). Однако имеется несколько примеров выделенных из разных источников ферментов, вносящих разры­вы в одинаковые последовательности-мишени. Такие ферменты называют изошизомерами. Кроме того, было обнаружено, что некоторые ферменты узнают тетрануклеотидные последователь­ности. Иногда такие тетрануклеотиды находятся внутри гекса- нуклеотидных последовательностей-мишеней для других фермен­тов. Например, рестриктазы MboI и Sau3A узнают последова­тельность

. 5'( 3'

,..G-A-T-C...

...C-T-A-G .

3' | 5

1 -

в то время как рестриктаза BamHI узнает последовательность

г • '

5* I V

T..G G-A-T-C-C.7.

Из предположения, что участки узнавания рестриктирующих эндонуклеаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, следует, что тетрануклеотидная мишень для МЬо\ и SatiSA должна встре­чаться в среднем один раз на каждые 4⁴ (т. е. 256) нуклеоти­дов, тогда как^хгексаиуклеотидная мишень для BamHI должна встречаться один раз на 4^б (т. е. 4096) нуклеотидов. Фрагменты ДНК, полученные при полном или частичном расщеплении эука­риотической ДНК ресТриктазами MboI и Sau3A, можно, сле­довательно, клонировать или субклонировать в составе вектор-

ной ДНК (такой, как ДНК бактериофага Я или pBR322), обра­ботанной BamHI. Следует иметь в виду, что в большинстве слу­чаев соединение МЬо\- и BamHI-фрагментов не приводит к вос­становлению сайта для BamHI. Поэтому расщеплением реком­бинантной молекулы рестриктазой BamHI обычно не удается выделить Л4&о1-фрагмент, встроенный в BamHI-вектор.

В некоторых случаях в результате сшивания фрагментов, по­лученных с помощью двух разных рестриктаз, образуются гиб­риды, не содержащие сайтов рестрикции ни для одного из этих ферментов. К примеру, при сшивании фрагментов, полученных с помощью рестриктаз Sa/I(G|TCGAC) и Xhol (CjTCGAC), об­разующийся гибрид не расщепляется ни Sail, ни Xhol:

5*

...6

...C-A-G-C-T

T-C-G-A-G ... С...

3*

5'

⁵...G-T-C-G-A-G ...C-A-G-C-T-C ...

3‘

МЕТИЛИРОВАНИЕ

Большинство штаммов E. coli содержит два фермента, мети­лирующих ДНК: метилазу dam и метилазу dcm. '

Метилаза dam. Этот фермент метилирует атом N⁶ аденина в последовательности ⁵'GATC³' (Hattman et al., 1978). Такая по­следовательность входит в состав сайтов рестрикции для не­скольких рестриктаз (Pvul, BamHI, Bell, Bglll, Xholl, Mbol, Sau3A) и части сайтов рестрикции для Clal (1 сайт из 4), Xbal (1 сайт из 16), Taql (1 сайт из 16), Mboll (1 сайт из 16) и Hphl ( 1 сайт из 16). Влияние метилирования, осуществляемого dam-метилазой, на расщепление ДНК этими ферментами сумми­ровано в табл. 4.2.

Ингибирование метилазой dam расщепления прокариотиче­ской ДНК рестриктазой Mbol не приводит к практическим ос­ложнениям, поскольку Sau3A узнает ту же последовательность, что и MboI, но не зависит от метилирования, осуществляемого метилазой dam. (Следует иметь в виду, что эукариотическая ДНК не метилируется в положении N⁶ аденина, и поэтому MboI и Sau3A могут быть использованы с равным успехом.) Однако, когда необходимо расщепить прокариотическую ДНК по всем возможным сайтам рестриктазами Clal, Xbal, Taql, Mboll или Я/Ш или расщепить полностью рестриктазой Bell, ее необходи­мо получать из Лхт~-штаммов Е. coli (Marinus, 1973; Backman, 1980; Roberts et al., 1980; McClelland, 1981; J. Brooks, неопубли­кованные данные).

Ферменты, вызывающие образование комплементарных липких концов²)

GT 1 (ст )^{АС g}(g) I ^С0(с)С

AGJCT

TGCjGCA

СС J (^)GG

GjGNCC

TTJCGAA

CC 1 (£)GG

GjPyCGPuG

G 1 G(^)CC

CCTAGG

TGGjCCA

GjGATCC

GC(a)GC

TIGATCA

GCCNNNN|NGGC

AjGATCT

QT i (X) (?)AC

GjGTNACC

Асу I³), Asu\P\ Cla\^z\ HpaU*\ TaqW

Accl³⁾_t i4s«II, Clal, Hpall, Taql Тупые⁴ > .

Accl³\ Acyl, C/al, Hpall, Faf/I

Sa/I³⁾, X/ioI³\ Xmal³>

5a«961³⁾

Тупые

£dl, Sg/II, Affrol, 5a«3A, XftoII

BamHI, Bg/II, Mbol, Sau3A, X/ioII aawHI/ВсИ, MM, 5aw3A_? До11

Последовательность, узнаваемая, ферментом

Ферменты, вызывающие образование комплементарных липких концов²)

GjANTC

GTTJAAC

CJCGG

GGTGANNNNNNNNj

CCACTNNNNNNN¹»

GGTACjC

|GATC

GAAGANNNNNNNNI

CTTCTNNNNNNN')

CCTC

CjCGG

C|C^MeGG

TGCGCA

CTCGAjG

CGATCG

CAG^CTG

GTJAC

GAGCTjC

CCGCjGG

ACGT

GjTCGAC

jGATC

G^M'ATC

G|GNCC

CCCjGGG

GCATG|C

GAGCT1C

CCGCjGG

ACGT

TjCGA

CGjCG

AccI³, Acyl, /IsuII, Clal, Taql

BamHI, Bell, BglII, Xholl

Тупые

>

Ava\*\ Xhol

BamHI, Bell Bglll, Mbol, Xholl

Тупые

AccP\ Acyl, Asull, Clal, Hpall Тупые

о>

*•

Xbal

Xhol

Xholl

Xmal

Xmalll

Xorll

Sma I Pvul, RshI

Высокая

»

Низкая

37

37

37

37

37

37

TjCTAGA

CjTCGAG

(g) J gatc®

CjCCGGG

CjGGCCG

CGATCjG

AvaP\ Sail

BamHI, Bell, Bglll, Mbol, Sau3A Aval³)

') См. табл. 4.4.

²) В этом столбце приведены ферменты, вызывающие образование концов, которые могут быть сшиты с концами, полученными с помощью ферментов первого столбца. В некоторых случаях, однако, образовавшийся гибридный участок не может быть расщеп­лен ни одним из исходных ферментов. Например, Bglll расщепляет последовательность

i

aVa-t-C-t

т-с t-a-GiA

а Ват HI расщепляет последовательность

G^G-A-T-C-G С-С -Т-A-G|C

Оба фермента приводят к образованию фрагментов ДНК с идентичными выступающими липкими 5'-концами. Эти концы могут быть сшиты вместе С образованием гибридного участка, который не способен узнать ни один из двух ферментов:

A G А-1 - С -С Т-С-Т.A-G G

а

Аналогичная ситуация наблюдается с рестриктазами Sail и Xhol. '

³) При обработке ДНК ферментами, расщепляющими вырожденные последовательности, образуются популяции фрагментов ДНК

с различающимися концевыми последовательностями. Эти концевые последовательности могут сшиваться только в некоторых ком­

бинациях. .

*) Фрагменты с тупыми концами, полученные с помощью этих ферментов, могут быть пришиты к любым другим аналогичным

фрагментам.

■ ^ I- л u J. — ... „ JL IJJ JCJ I- v ■ JU х I Л-¹¹ .. ■■■ '.И* ■ ,'.¹ ■■ . ■ ...N ,1 ¹ _ ■ Л/'МЛ¹ .^'-1 . JLL4.—

Метилаза dcm. Этот фермент метилирует атом С⁵ цитозина в последовательностях ⁵'C^meCAGG³' или ⁵'C^meCTGG³' (Marinus, Morris, 1973; May, Hattman, 1975). Метилирование, осуществляе­мое dcm, влияет в основном на работу £coRII. В большинстве случаев это не создает дополнительных препятствий, поскольку

8*

Проведение расщепления ДНК рестриктазами

Реакционная смесь обычно содержит 0,2—I мкг ДНК В объеме 20 мкл или менее.

1. Добавьте воду к раствору ДНК в стерильной пробирке фирмы «Эппендорф» (будем называть ее в дальнейшем эппен- дорфовской) до объема 18 мкл и перемешайте.

2. Добавьте 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной кон­центрации и перемешайте, Слегка постукивая по пробирке паль­цем.

3. Добавьте 1 ед. рестриктазы и перемешайте, слегка посту­кивая по пробирке пальцем. (1 ед. фермента — это количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК .за 1 ч в определенном буфере и при определенной температуре в объеме 20 мкл. Как правило, расщепление рестриктазами, про­водимое в течение более длительных периодов времени или при избытке фермента, не приводит к осложнениям, если в препара­те фермента отсутствуют примеси ДНКазы или экзонуклеазы. В имеющихся в продаже препаратах рестриктаз такие примеси обнаруживаются редко.)

4. Инкубируйте смесь при подходящей температуре в тече­ние необходимого времени.

5. Остановите реакцию добавлением 0,5 М ЭДТА, pH 7,5, до конечной концентрации 10 мМ.

Если ДНК анализируют сразу в геле, добавьте 6 мкл Краси­теля в буфере для нанесения I (с. 400), перемешайте смесь встряхиванием и нанесите расщепленную ДНК на гель.

Если обработанная рестриктазой ДНК нуждается в очистке, экстрагируйте ее один раз смесью фенол — хлороформ, один раз хлороформом и осадите этанолом (подробное описание см. на с. 405).

Примечания

Рестриктазы — дорогие ферменты! Связанные с ними затра­ты могут быть сведены к минимуму, если следовать приведен­ным ниже советам.

А. Многие имеющиеся в продаже препараты рестриктаз по­ставляются в виде концентрированных растворов. Часто для рас­щепления 10 мкг ДНК за 1 ч бывает достаточно 1 мкл препара­та. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаков­ки, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермен­та. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента. Или же можно присоединить к шприцу фирмы «Гамильтон» объемом 1 мкл пластмассовый шланг (длиной

1 см) и использовать его для отбора объемов 0,1 мкл. После отбора каждой пробы пластмассовый шланг выбрасывают.

Б. Рестриктазы стабильны при хранении при —20 °С в буфе­ре, содержащем 50% глицерина. При проведении расщепления ДНК рестриктазами приготовьте реакционную смесь, содержа­щую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозиль­ника фермент и сразу же поместите его в лед. При каждом от­боре фермента используйте чистую стерильную пипетку. Загряз­нение фермента ДНК или другим ферментом может привести к дополнительным затратам времени и средств. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.

В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней количество воды, насколько это возможно. Про­верьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее Ую конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.

Г. Часто количество фермента может быть уменьшено за счет увеличения времени реакции. При обработке больших ко­личеств ДНК это дает значительную экономию. Для контроля степени расщепления во время реакции можно отбирать не­большие аликвоты и анализировать их в мини-геле (с. 167).

Д. При обработке большого числа проб ДНК одним и тем же ферментом рассчитайте его общее необходимое количество. Отберите нужное количество раствора фермента из упаковки и смешайте его с необходимым количеством воды и буфера (10Х) для рестрикции. Внесите аликвоты смеси фермент — буфер в ре­акционные смеси.

Е. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рест­риктазами, реакцию можно проводить одновременно при усло­вии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфе­ре. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. Пос­ле этого в реакционную смесь можно добавить необходимое ко­личество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить ин­кубацию.

Ж. Если объем реакционной смеси при проведении рестрик­ции слишком велик для его нанесения в ячейку геля, ДНК мож­но сконцентрировать следующим простым способом. После оста­новки реакции добавлением ЭДТА добавьте ²/з объема 5 М аце­тата аммония и 2 объема этанола. Охлаждайте в бане с сухим Льдом и метанолом в течение 5 мин, затем процентрифугируйте

5. мин в центрифуге Эппендорф. Отбросьте надосадочную жид­кость, содержащую основную часть белка. Быстро высушите осадок под вакуумом. Растворите ДНК в подходящем объеме буфера ТЕ, pH 7,6 (с. 393).

ДРУГИЕ ФЕРМЕНТЫ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ

Помимо рестриктирующих эндонуклеаз в молекулярном кло­нировании обычно используют и многие другие ферменты. Их свойства описаны в последующих разделах. В некоторых слу­чаях мы приводим прописи с описаниями условий специфиче­ских ферментативных реакций. В других мы отсылаем читателя к руководствам, в которых можно найти прописи нужных ме­тодик. Наконец, для создания полной картины мы даем описа­ние свойств нескольких ферментов, которые иногда использу­ются в молекулярном клонировании, но не являются необходи­мыми для проведения описанных в этом руководстве экспери­ментов. Детальное описание практического использования таких ферментов читатель может найти в цитируемых 'работах.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА I £. coli

Ник-трансляция ДНК

ДНК-полимераза I Е. coli присоединяет нуклеотидные остат­ки к З'-гидроксильному концу, который образуется при разрыве * (по-английски — nick) одной из цепей двухцепочечной молекулы ДНК. Кроме того, благодаря своей 5'-—►З'-экзонуклеазной ак­тивности фермент может удалять нуклеотиды с 5'-конца, обра­зующегося при разрыве. Удаление нуклеотидов с б'-конца раз­рыва и последовательное добавление нуклеотидов к З'-концу приводят к перемещению разрыва вдоль цепи ДНК (ник-транс­ляции) (Kelley et al., 1970). Заменяя нуклеотиды, формирующие цепь ДНК, на радиоактивные, можно получить меченную ³²Р ДНК с удельной активностью, превышающей 10⁸ имп/(мин*мкг) (Maniatis et al., 1975; Rigby et al., 1977).

1. Обычно реакционная смесь содержит 1 мкг ДНК в объеме 50 мкл. Однако реакцию можно проводить и в меньших объемах, вплоть до 5 мкл.

2. ДНК-полимераза I Е. coli может работать в смеси с dNTP в таких низких концентрациях, как 2 мкМ, однако более эффек­тивно фермент синтезирует ДНК при больших концентрациях субстратов. Исходя из соображений экономии, реакции ник- трансляции проводят при минимальных концентрациях (2 мкМ) меченых dNTP и существенно более высоких концентрациях (20 мкМ) немеченых dNTP. Таким образом, в реакционной сме­си объемом 50 мкл содержится 1 нмоль каждого из немеченых dNTP и 100 пмоль каждого из меченых dNTP. Удельная актив­ность полученной в результате ник-трансляции ДНК зависит в

_ о

свою очередь от соотношения в реакционной смеси меченых и немеченых dNTP. Когда требуется высокая (>10⁸ имп/мин на

1. мкг ДНК) удельная активность ДНК (например, для иссле­дования библиотек рекомбинантных ДНК или для обнаружения уникальных последовательностей эукариотической ДНК при гибридизации по Саузерну) в реакции ник-трансляции должно участвовать по 200 пмоль каждого из четырех dNTP, меченных ³²Р в a-положении (уд. акт. > 800 Ки/ммоль).

Для большинства других целей разумно использовать один dNTP, меченный ³²Р в a-положении, и три немеченых dNTP, или разбавлять каждый [a-³²P]dNTP соответствующим количе­ством немеченого dNTP.

3. Большинство поступающих в продажу препаратов [a-³²P]dNTP выпускается в виде концентрированных водных рас­творов, которые можно непосредственно добавлять в реакцион­ную смесь для проведения ник-трансляции. Удельная активность этих препаратов колеблется от 400 до 2000 Ки/ммоль. При ис­пользовании [a-³²P]dNTP, растворенных в смеси этанол — вода, этанол и воду удаляют, как описано на с. 401.

4. Реакцию ник-трансляции проводят в следующей смеси: 5 мкл буфера (ЮХ) для ник-трансляции, 1 мкг ДНК, 1 нмоль каждого (1 мкл 1 мМ раствора) немеченого dNTP (при необхо­димости), 100 пмоль [a-³²P]dNTP и Н₂0 до объема 44 мкл. Смесь охлаждают до 0°С. Разводят в 10 000 раз небольшое количество исходного раствора ДНКазы (1 мг/мл) в охлажденном буфере для ник-трансляции, содержащем 50%-ный глицерин. Разбав­ленный фермент стабилен при хранении при —20 °С в этом бу­фере (с. 397).

5. Добавляют в реакционную смесь 0,5 мкл разбавленной ДНКазы I (0,1 мкг/мл) и перемешивают с помощью встряхива­ния.

6. Добавляют 5 ед. (Richardson et al., 1964) ДНК-полимера- зы I Е. coli и перемешивают.

7. Инкубируют при 16 °С в течение 60 мин.

Примечание. Если реакцию проводят при более высокой тем­пературе, в результате копирования ДНК-полимеразой новосин- тезированной цепи может образоваться значительное количество «схлопнувшейся» ДНК.

16*С

20 °С

или больше

9. Реакцию останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА.

10. Используя связывание с DE-81 или осаждение с помощью

В. Ферменты, используемые при⁴ ник-трансляции, чувстви­тельны к примесям агарозы. Поэтому перед ник-трансляцией ДНК, элюированной с агарозного геля, ее следует тщательна очистить, как описано в гл. 5.

Г. В некоторых случаях (например, для анализа гибридов ДНК — РНК с помощью нуклеазы S1) желательно получать ник-транслированную ДНК, длина которой значительно превы­шает 400—800 нуклеотидов. С этой целью:

1. проведите реакцию ник-трансляции с использованием оп­тимального количества ДНКазы I, определив его, как описано, выше;

2. добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА. Для инактивации ДНК-поли­меразы и ДНКазы смесь прогрейте при 70°С в течение 5 мин;

3. добавьте 150 мкл 10 мМ MgCl₂ и 20 мкл буфера (I0X) для лигирования (сшивания; с. 135);

4. Добавьте 2 ед. лигазы фага Т4;

5. проинкубируйте при комнатной температуре в течение

2 ч;

6. после ник-трансляции и обработки лигазой отделите ДНК от невключившихся dNTP колоночной хроматографией на се- фадексе G-50 или хроматографией с использованием центрифу­гирования (с. 407—410);

7. определите размер ДНК методом электрофореза в щелоч­ном агарозном геле (с. 174);

8. при необходимости выделите ДНК требуемого размера после разделения в щелочном агарозном геле.

Исходные растворы

Буфер (10х) для ник-трансляции имеет состав: 0,5 М трис- НС1, pH 7,2, 0,1 М MgS0₄, 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA, Pentax Fraction V). Разделите буфер на небольшие аликвоты и храните при —20 °С.

ДНКаза I. Приготовьте исходный раствор, содержащий

1. мг/мл фермента в 0,15 М NaCl и 50%-ном длицерине. (Элект- рофоретически чистую ДНКазу I производит фирма Worthing­ton Biochemicals.) Разделите раствор на небольшие аликвоты и: храните их при —20 °С. Раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов имеет состав: 1 мМ dATP, 1 мМ dGTP, 1 мМ dCTP и 1 мМ ТТР.

Исходные растворы приготовьте, как описано на с. 396.

ДНК-полимераза I Е. coli. Большинство фирм, продающих препараты фермента, поставляет их в буфере, содержащем 50%-ный глицерин. Обычно в 1 мкл препарата содержится 5 ед. фермента. [Определение 1 ед. фермента дано Ричардсоном и др. (Richardson et al., 1964).]

ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ I Достраивание укороченных З'-концов двухцепочечной

ДНК

Условия реакции идентичны используемым при ник-трансля­ции ДНК, за исключением того, что а) вместо голофермента ис­пользуют фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Е. coli; б) не ис­пользуют ДНКазу; в) обычно меченым является только один из четырех dNTP,

Какие dNTP следует вносить в реакционную смесь, зависит

U ^ / Ц*

от последовательности основании выступающих 5-концов цепей ДНК. Например, для достраивания укороченных З'-концов ДНК, образующихся при расщеплении рестриктазой £coRI, в реак­ции должны участвовать только dATP и ТТР:

5‘ 5'

р*Ср-Тр-Тр-Ар-Др Ср - Тр-Тр-Ар-Ар

dATP

p^Gl ттр "* G “рА -_рА -_рТ -рТ-|

ОН ОН ,

3' . 3

Вместе с тем для достраивания укороченных концов, образо­вавшихся при расщеплении рестриктазой tfmdlll, необходимо присутствие всех четырех dNTP:

5' d AT Р 5'

р -Тр-Тр-Ср*Gp* Ар dGTP ^ Тр-Тр-С_р-Gp-Ар

р^АЧ ^d5}p A-pA-pG -pC-pT-j

он, ^ТТР он

3 з

Наконец, для репарации концов, образовавшихся после об­работки ДНК нуклеазой S1 или рестриктазой Ва/31, в реакции должны участвовать все четыре dNTP.

Обычно в реакционной смеси содержится 1 мкг ДНК в объеме 20 мкл. Однако реакция хорошо протекает в очень широ­ком диапазоне концентраций ДНК (1—500 мкг/мл).

1. Смешайте 1 мкг ДНК, 2 мкл буфера (10Х) для ник- трансляции, 2 нмоль каждого (1 мкл 2 мМ раствора) немечено­го dNTP (при необходимости), 2 пмоль (уд. акт. 400 Ки/ммоль) [a-³²P]dNTP, 1 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы и Н₂0 до объема 25 мкл.

2. Проинкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.

3. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА. Проэкстрагируйте один раз смесью фенол — хлороформ (с. 403).

4. Отделите ДНК от невключившихся dNTP на микроколон­ках с сефадексом G-50 обычной хроматографией или хромато­графией с использованием центрифугирования (с. 407—410).