На уровне полосы бактериофага наклейте на пробирку полоску липкой ленты. Затем проткните стенку пробирки через

г.мг

гЧ'¹

Фис. 3.1. Градиенты хлористого цезия для очистки бактериофага X. Частицы ♦ бактериофага образуют видимую полосу на границе между слоями хлористого цезия с плотностями 1,45 и 1,50 г/мл.

Рис. 3.2. Отбор бактериофага с помощью прокалывания стенки пробирки.

Примечания. 1. Бактериофаг К чрезвычайно чувствителен к: ЭДТА, и для предотвращения его разрушения важно, чтобы на всех этапах очистки присутствовали ионы Mg²⁺ (в концентрации! 10—30 мМ).

2. Если выход очищенного фага оказывается низким, то еле- дует выяснить, на каком этапе происходят потери. Для этого' нужно определить число инфекционных частиц бактериофага в- пробах, отобранных на разных стадиях очистки.

Другие методы очистки бактериофага К

Описанный выше метод очистки бактериофага является, па< сути, методом, предложенным Ямамото и др. в 1970 г. (Yamamo­to et al., 1970). С годами в него было внесено много изменений, а некоторые стадии были исключены совсем. Ниже приводятся! три слегка модифицированные процедуры.

Осаждение частиц фага

1. Проведите очистку по Ямамото до стадий 8 включительно» (экстракция хлороформом) (с. 92—93).

2. Соберите частицы бактериофага центрифугированием при. 25000 об/мин в течение 2 ч при 4°С в роторе Beckman SW27“ (или аналогичном ему).

3. Слейте надосадочную жидкость. На дне пробирок должен» быть виден стекловидный осадок частиц бактериофага. В каж-

дую пробирку добавьте по 1—2 мл среды SM и оставьте их на лочь при 4°С. Можно поместить пробирки на качающуюся плат­форму.

4. На следующее утро осторожно пипетируйте раствор, чтобы ресуспендировать все частицы бактериофага.

Хотя таким способом получаются не такие чистые препараты, как при равновесном центрифугировании в градиенте, их можно использовать как источник ДНК для получения плеч молекулы ДНК бактериофага X.

Приступайте к выделению ДНК со стадии 5 (с. 97).

Ступенчатый градиент глицерина¹

1. Проведите очистку по Ямамото до стадии 6 включительно (с. 92—93).

2. Ресуспендируйте осадок фага в буфере ТМ (50 мМ трис- НС1, pH 7,8, и 10 мМ MgS0₄), добавляя 5—10 мл буфера в рас­чете на 1 л исходной культуры.

3. Один раз проведите экстракцию суспензии бактериофага хлороформом.

4. Приготовьте ступенчатый градиент глицерина в прозрач­ных пробирках для ротора Beckman SW41 (или подобных ему):

а) на дно пробирки налейте пипеткой 3 мл буфера ТМ, со­держащего глицерин в концентрации 40%;

б) сверху осторожно наслоите 4 мл буфера ТМ, содержаще­го глицерин в концентрации 5%;

в) на раствор с глицерином осторожно наслоите суспензию

бактериофага;

т) заполните пробирку доверху буфером ТМ. ,

5. Отцентрифугируйте препарат при 35000 об/мин и 4°С в течение 60 мин.

6. Слейте надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок 'бактериофага в буфере ТМ (1 мл в расчете на 1 л исходной культуры).

7. Добавьте панкреатическую ДНКазу и панкреатическую РНКазу до конечных концентраций 5 и 1 мкг/мл соответственно. Проинкубируйте 30 мин при 37 °С.

8. Добавьте ЭДТА (0,5 М, pH 8,0) до конечной концентра­ции 20 мМ.

9. Приступайте к выделению ДНК со стадии 5 (с. 97). Равновесное центрифугирование в хлористом цезии

Когда имеют дело с небольшими количествами препарата бактериофага (полученными из 1 л или менее), то центрифуги­рование в ступенчатом градиенте хлористого цезия можно опу­стить.

¹ Методика из работы Vande Woude et al., 1979, с модификациями.

1. После экстракции хлороформом (стадия 8) измерьте

объем водной фазы и добавьте сухой хлористый цезий в расчете

0. 75 г на 1 мл. Осторожно перемешивайте до полного раство­рения. *

2. Когда хлористый цезий растворится, перенесите суспензию бактериофага в пробирку от ультрацентрифуги. Можно исполь­зовать пробирки как для углового ротора, так и для бакет-рото- ра. Заполните пробирку доверху буфером ТМ с хлористым це­зием (0,75 г/мл).

3. Проведите центрифугирование и соберите бактериофаг, как это описано на с. 94.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА X

1. Удалите хлористый цезий из препарата очищенного бак­териофага посредством диализа при комнатной температуре в течение 1 ч против 1000-кратного объема буфера следующего состава: 10 мМ NaCl, 50 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ MgCl₂.

2. Перенесите диализный мешок в сосуд со свежим буфером

и 1

и диализуите еще в течение I ч.

3. Перенесите суспензию бактериофага в центрифужную пробирку такого объема, чтобы она заполнилась лишь на треть.

4. Добавьте ЭДТА (0,5 М, pH 8,0) до конечной концентрации 20 мМ.

5. Добавьте проназу до конечной концентрации 0,5 мг/мл или же протеиназу К до конечной концентрации 50 мкг/мл.

6. Добавьте SDS (основной водный раствор, 20% по объему) до конечной концентрации 0,5%. Перемешайте содержимое про­бирки, несколько раз перевернув ее.

7. Проинкубируйте препарат I ч при 37 °С (в случае прона- зы) или при 65°С (в случае протеиназы К).

8. Добавьте равный объем насыщенного буфером фенола (с. 388). Перемешайте содержимое пробирки, несколько раз перевернув ее. Разделите фазы путем центрифугирования при 1600 g в течение 5 мин при комнатной температуре. Перенесите водную фазу в чистую пробирку, пользуясь пипеткой с широким носиком.

9. Один раз экстрагируйте водную фазу смесью насыщенного буфером феносла и хлороформа (50:50).

10. Соберите водную фазу, как это описано выше, и экстра­гируйте ее один раз равным объемом хлороформа.

11. Перенесите водную фазу в диализный мешок.

12. Проведите диализ в течение ночи при 4°С последователь­но против трех 1000-кратных объемов буфера ТЕ (10 мМ трис-НС], pH 8,0, и 1 мМ ЭДТА).

7—164

ВЫДЕЛЕНИЕ БОЛЬШИХ КОЛИЧЕСТВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими мето­дами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

В этих методах очистки так и!ли иначе используют два ос­новных различия между“~ДНК Escherichia coli и плазмидной

ДНК: 1) хромосома Е. co/t"по размеру много больше ДЙК" плаз­мид. обычно используемых в качестве векторов; 2) основная масса ДНК Е. colt выделяется из клеток в^ вице фрагментиро­ванных линейных молекул, тогда как большинство "гглаз^шдной

ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых

молекул. . ^

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно^дл^шньгё^

coli, случайно захваченные обломками лизирован- ных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементар­ных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое,.кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав'одну из них) в тех условиях, при которых происхо­дит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (дсРрН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному ]!№*гаэдгнутые кольцевые молекулы вновь прини­мают нативную конформацию, тогда как ДНК Е. coli остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК Е. coli также и при равновесном центрифугировании в градиентах хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интёркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистый этидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и по­тому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркали- рующий агент, оказываются в адаах с 6п.т)рр_выгокпй_плотностью (Radloff et al., 1967). Эту методику используют, если необходи­ма высока^ степень^очисткн Плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работьГсГрекомбинантными ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку боль­ших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы пре­парат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирую- щими эндонуклеазами, лигирование, трансформация и даже секвенирование ДНК можно .проводить теперь, используя отно­сительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, получен­ные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмид- ную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее количества (например,

в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5'-концы фрагментов ДНК с помощью лолинуклеотидкиназы).

Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бак­терий. Вообще говоря, чем меньше,,цлазмида^.1£м_ь.лучше дости­гаемые результаты. С увеличением^длекуляраои массы плазми­ды ее свойства становятся*"все ближе к свойствам ДНК хозяи­на. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, силь­но затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все илазмиды, обычно используемые при клонировании, относитель­но невелики и приведенные ниже методы дают хорошие резуль- - та ты,

РОСТ БАКТЕРИЙ И АМПЛИФИКАЦИЯ ПЛАЗМИДЫ

Амплификация в богатой среде

В течение многих лет считали, что амплификация плазмид в присутствии хлорамфеникола происходит эффективно лишь при выращивании бактерии-хозяина в синтетической среде. Однако приводимая ниже процедура дает воспроизводимо высокие выхо­ды (>2 мг плазмиды на 1 л культуры) при использовании штам­мов Е. coli, содержащих плазмиды с решшконом ColEl.

1. Засейте 10 мл среды LB, содержащей соответствующий антибиотик, отдельной колонией бактерии. Проинкубируйте в течение ночи лри температуре 37°С при интенсивном встряхи­вании.

2. На следующее утро посейте 0,1 мл ночной культуры в 25 мл среды LB с соответствующим антибиотиком в колбе на 100 мл. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхива­нии до тех пор, пока культура не достигнет поздней логарифми­ческой фазы .( £бао = 0,6).

3. Внесите 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе в 500 мл среды LB с соответствующим антибиотиком, предва­рительно прогретой до 37 °С в колбе на 2 л. Проинкубируйте ровно 2,5 ч при 37 °С при энергичном встряхивании. D₆оо куль­туры должна составить примерно 0,4.

4. Добавьте 2,5 мл раствора ^зу^а^микрла (34 мг/мл в этаноле). Конечная концентрация хлорамфеникола в культуре должна быть 170 мкг/мл.

5. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхивании

еще 12—16 ч. .

Амплификация в минимальной среде

Хотя в настоящее время эта процедура (Clewell, Helinski, 1972) в значительной степени вытеснена той, которая была при­ведена выше, ее все еще можно использовать в случае релакси- рованных плазмид с репликонами, отличными от ColEl.

7*

1. Отобрав отдельную колонию, выросшую в присутствии соответствующего антибиотика, засейте ею 10 мш богатой среды (например, LB) с этим антибиотиком. Инкубируйте в течение ночи.

2. Посейте 2,5 мл ночной культуры в колбу объемом 2 л, со­держащую 500 мл минимальной среды (М9) с соответствующим антибиотиком. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхивании до тех пор, пока Азоо культуры не достигнет 0,4—

0. 5. Очень важно, чтобы концентрация клеток не была выше, так как при этом снизится эффективность амплификации.

3. Добавьте раствора хлорамфеникола (34 мг/мл в

этаноле). Продолжайте инкубацию еще в течение 12—16 ч.

СБОР БАКТЕРИЙ И ЛИЗИС

Сбор бактерий

1. Соберите бактериальные клетки центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 4°С. Слейте надосадочную жид­кость.

2. Промойте клетки 100 мл охлажденного во льду буфера STE (0,1 М NaCl, 10 мМ трис-НС1, pH 7,8, 1 мМ ЭДТА).

Лизис

Ниже приведены три различные методики лизиса. Первые две, лизис кипячением и лизис щелочью, отличаются высокой эффективностью и в случае малых плазмид (<10 kb) дают вы­ход 2—3 мг/л. Третий метод сравнительно более мягкий, и им следует пользоваться в случае больших плазмид (>10 kb).

Лизис кипячением¹

1. Ресуспендируйте осадок бактерий, полученный из куль­туры объемом 500 мл, в 10 мл буфера STE (0,1 М NaCl, 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА). Перенесите смесь в колбу Эршенмейера на 50 мл.

2. Добавьте 1 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (20 мг/мл в 10 мМ трис-НС1, pH 8,0).

Примечание. Лизоцим не будет работать эффективно, если pH раствора ниже 8,0. -

3. Пользуясь зажимом, подержите колбу Эрленмейера над открытым огнем бунзеновской горелки до тех пор, пока жид­кость в ней не начнет кипеть. Колбу все время встряхивайте.

¹ Holmes, Quigley, 1981.

4. Сразу же перенесите колбу в большую баню (объемом

2. л) с кипящей водой. Держите колбу в кипящей воде в течение 40 с.

5. Охладите колбу, поместив ее на 5 мин в ледяную баню.

6. Перенесите вязкое содержимое колбы в центрифужную пробирку (от ротора Beckman SW41 или аналогичного ему). Отцентрифугируйте при 25 000 об/мин в течение 30 мин при 4°С.

7. Очистите плазмидную ДНК равновесным центрифугирова­нием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием (с. 103).

Лизис щелочью¹

1. Ресуспендируйте полученный из 500 мл культуры осадок бактерий в 10 мл раствора I, содержащего лизоцим в концентра­ции 5 мг/мл.

Раствор I. 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ ЭДТА.

Раствор I можно приготовить порциями примерно по 100 мл, проавтоклавировать в течение 15 мин при давлении 7-10⁴ Па и хранить при 4°С. Сухой лизоцим следует растворять в нем не­посредственно перед использованием.

2. Перенесите суспензию в полиалломерные пробирки от ро­тора Beckman SW27 (или аналогичного ему). Оставьте на 5 мин при комнатной температуре.

3. Добавьте 20 мл свежеприготовленного раствора II. За­кройте пробирку сверху парафильмом и перемешайте содержи­мое, несколько раз осторожно перевернув пробирку. Поставьте на 10 мин в лед.

Раствор II. 0,2 н. NaOH, 1% SDS.

Раствор II следует готовить из исходных растворов 10 н.

NaOH и 20% SDS.

4. Добавьте 15 мл охлажденного во льду 5 М ацетата калия, pH 4,8, приготовленного следующим образом: к 60 мл 5 М аце­тата калия добавьте 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и 28,5 мл Н₂0. Получающийся раствор является 3 М по ка'лию и 5 М по ацетату. Закройте пробирку сверху парафильмом и перемешайте содержимое, несколько раз резко перевернув пробирку. Оставьте во льду на 10 мин.

5. Отцентрифугируйте в роторе Beckman SW27 (или анало­гичном ему) при 20 000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Бак­териальная ДНК и обломки клеток должны образовать на дне пробирки плотный осадок.

6. Перенесите по равному объему (~18 мл) надосадочной жидкости в две пробирки Согех объемом по 30 мл.

¹ Эта процедура описана Бирнбоймом и Доли (Birnboim, Doly, 1979) и модифицирована Иш-Горовицем (личное сообщение).

■ ^J7. Добавьте в каждую пробирку 0,6 объема (~12 мл) изо­пропанола. Хорошо перемешайте и оставьте на 15 мин при ком­натной температуре.

8. Осадите ДНК центрифугированием в роторе Sorvall при 12 ООО g в течение 30 мин при комнатной температуре.

Примечание. Если центрифугирование проводить при 4°С, то может выпасть в осадок соль.

9. Слейте надосадочную жидкость. Промойте осадок 70%-ным этанолом при комнатной температуре. Слейте как можно боль­ше этанола, затем высушите осадок нуклеиновой кислоты, поместив пробирки на короткое время в вакуумный испаритель.

10. Растворите осадки в буфере ТЕ, pH 8,0, чтобы суммар­ный объем смеси составлял 8 мл.

11. Очистите плазмидную ДНК, проведя равновесное центри­фугирование в градиенте плотности хлористого цезия с броми­стым этидием (с. 103).

Примечание. Как ни удивительно, этот метод дает хорошие результаты также и в случае плазмид, которые были амплифи- цированы в присутствии хлорамфеникола. При длительной об­работке клеток этим лекарственным препаратом образуются плазмиды, ДНК которых частично замещена рибонуклеотидны- ми последовательностями. Так как эти небольшие последова­тельности должны расщепляться щелочью, можно ожидать, что при использовании этой методики получатся препараты, в кото­рых необычно много кольцевых молекул с одноцепочечными раз­рывами. Однако в наших препаратах ДНК разрывы содержа­лись менее чем в 5% молекул.

Лизис под действием SDS¹

1. Ресуспендируйте осадок бактерий в 10 мл охлажденного во льду буфера следующего состава; 10%-ная сахароза, 50 мМ трис-HCl, pH 8,0. Перенесите суспензию в пробирку Oak Ridge на 30 мл.

2. Добавьте 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10 мг/мл в 0,25 М трис-НС1, pH 8,0).

3. Добавьте 8 мл 0,25 М ЭДТА. Перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. Поместите в лед при 0°С на 10 мин.

4. Добавьте 4 мл 10%-ного SDS. Быстро перемешайте стек­лянной палочкой, чтобы SDS равномерно распределился по су­спензии бактерий, но в то же время достаточно осторожно, чтобы не повредить освобождающуюся бактериальную ДНК-

5. Сразу же добавьте 6,0 мл -5 М NaCl (конечная концентра­ция 1 М). Вновь осторожно, но тщательно перемешайте. Помес­тите в лед по крайней мере на 1 ч.

¹ Godson, Vapnek, 1973.

6. Чтобы удалить высокомолекулярную ДНК и обломки бак­терий, отцентрифугируйте в течение 30 мин при 30 000 об/мин при 4°С в роторе Beckman БОТi (или аналогичном ему).

7. Слейте и сохраните надосадочную жидкость. Осадок, кото­рый должен быть твердым и плотным, выбросьте.

8. Проведите две экстракции надосадочной жидкости смесью фенол/хлороформ и одну экстракцию хлороформом. После каж­дой экстракции переносите водную фазу в чистую пробирку.

9. Перенесите водную фазу в стеклянный центрифужный ста­кан на 250 мл. Добавьте 2 объема (~60 мл) этанола. Хорошо перемешайте. Оставьте на 1—2 ч при —20°С или на 15 мин при —70 °С.

10. Осадите нуклеиновые кислоты центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин при 4 °С.

11. Вылейте надосадочную жидкость. Промойте осадок 70%-ным этанолом при комнатной температуре. Слейте как можно больше этанола. Высушите осадок, поместив стаканы на короткое время в вакуумный испаритель.

12. Растворите ДНК в буфере ТЕ, pH 8,0, чтобы суммарный объем смеси был равен 8 мл.

13. Очистите плазмидную ДНК с помощью равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием.

ОЧИСТКА КОВАЛЕНТНО ЗАМКНУТОЙ КОЛЬЦЕВОЙ

ДНК РАВНОВЕСНЫМ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕМ В ГРАДИЕНТЕ

ХЛОРИСТОГО ЦЕЗИЯ С БРОМИСТЫМ ЭТИДИЕМ

1. Измерьте объем раствора ДНК. На каждый миллилитр добавьте точно 1 г сухого хлористого цезия. Осторожно переме­шивайте до тех пор, пока соль не растворится.

2. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавьте

0. 8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в Н₂0). Конечная плотность раствора должна составить 1,55 г/мл (i)^ 1,3860), а концентрация бромистого этидия должна быть примерно 600 мкг/мл.

Примечание. Всплывающие на поверхность раствора пушис­тые пурпурные хлопья представляют собой комплексы бромисто­го этидия с бактериальными белками.

3. Перенесите раствор хлористого цезия (вместе с белковыми хлопьями) в центрифужные пробирки от ротора Beckman 50 или 65. Заполните пробирки доверху вазелиновым маслом.

4. Отцентрифугируйте при 45 000 об/мин в течение 36 ч при

5. При обычном освещении должны быть видны две полосы ДНК. Верхняя полоса — это линейная бактериальная ДНК и кольцевая плазмидная ДНК с одноцепочечными разрывами.