Глава 3

^ ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА % В БОЛЬШИХ КОЛИЧЕСТВАХ

Существуют два метода получения больших количеств бактериофага %. В первом из них бактерии заражают с низкой множественностью и засевают такой зараженной культурой большой объем среды. Сначала концентрация бактериофага в культуре оказывается низкой, и незаражен- ные клетки в ней продолжают делиться в течение несколь­ких часов. Однако в результате последовательных циклов инфекции образуются все большие и большие количества бактериофага. В конце концов все бактерии оказываются зараженными, и культура полностью лизирует. Следует иметь в виду, однако, что уже небольшое изменение соот­ношения между количеством фага и клеток при первичной инфекции сильно сказывается на конечном выходе бакте­риофага. Кроме того, оптимальное соотношение фага и клеток неодинаково для разных штаммов бактериофага Я и бактерий. Тем не менее, приложив некоторые усилия, этот метод можно применять для большинства комбинаций вируса и клеток-хозяев.

Второй метод включает индукцию лизогенных бактерий. Эта методика дает наилучшие результаты, если бактерио­фаг обладает температурочувствительным репрессором (cite). В этом случае можно индуцировать развитие фага по литическому пути, просто повысив на некоторое время температуру, при которой выращивают культуру. Метод этот очень прост, но, конечно, его можно использовать лишь в случае таких бактериофагов, которые приводят к образо­ванию стабильных лизогенов. Среди таких фагов имеется несколько полезных штаммов. Это штамм cl857?sSam7, для которого характерен большой выход фаговой ДНК и который может использоваться для получения ДНК стан­дартной молекулярной массы (маркера), а также штамм Xgt-ЯС, применяющийся в качестве вектора. Большинство же других используемых в настоящее время векторов не может приводить к образованию лизогенов.

ЗАРАЖЕНИЕ

Эта методика представлена множеством вариантов. Однако у нас наилучшие результаты получаются при использовании описываемой ниже процедуры (Blattner et al., 1977; Maniatis et al., 1978).

Для получения бактериофага из 2 л культуры зараженных бактерий проделайте следующее.

1. Посейте отдельную колонию соответствующей бактерии- хозяина в 100 мл среды NZCYM в колбе на 500 мл. Проинкуби­руйте смесь в течение ночи при 37 °С при интенсивном встряхи­вании.

2. Измерьте £>боо культуры. Определите концентрацию кле­ток, считая, что Z)₆oo =1 соответствует концентрации 8 -10⁸ клет­ка/мл.

3. Отберите четыре пробы по 10¹⁰ клеток в каждой. Осадите клетки центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Слейте надосадочную жидкость.

4. Каждый осадок бактерий ресуспендируйте в 3 мл сре­ды SM.

5. Добавьте бактериофаг и быстро перемешайте смесь. Коли­чество добавляемого бактериофага является существенным. Если штамм бактериофага X размножается хорошо (например, фаг XgtWES-ЯВ), то к каждой суспензии, содержащей 10¹⁰ клеток, добавляйте по 5-10⁷ частиц бактериофага. Если же бактериофаг растет относительно плохо (например, фаги серии Харон), та лучше увеличить количество добавляемого фага до 5*10® частиц. Однако эти правила не являются жесткими, и не исключено, что множественность заражения, которая даст наилучшие результа­ты при данных условиях, можно будет найти лишь опытным пу­тем.

6. Проинкубируйте смесь 20 мин при 37 °С, периодически встряхивая.

7. Внесите каждую -из проб, включающих по 10¹⁰ клеток, в колбу на 2 л, содержащую 500 мл предварительно прогретой при 37°С среды NZCYM. Проинкубируйте смесь при 37 °С, ин­тенсивно встряхивая. Параллельный рост бактерий и бактерио­фага, который должен происходить, приведет через 9—12 ч к ли­зису культуры.

Полностью лизировавшая культура содержит значительные количества обломков бактерий как в виде легкого осадка, так и в виде более крупных волокнистых сгустков. Если такую куль­^ТУРУ посмотреть на просвет, то не видно шелковистости и пере­падов показателя преломления, характерных для плотной нели- зировавшей бактериальной культуры.

8. Если на глаз не удается определить, произошел ли лизис, то проделайте следующее. Отберите из каждой зараженной

культуры в стеклянные пробирки по две пробы (по 1 мл). К од­ной из них добавьте 1—2 капли хлороформа. Проинкубируйте обе пробирки 5—10 мин при 37 °С, периодически встряхивая. Сравните вид этих культур, рассматривая пробирки на просвет. Если заражение было почти полным, но клетки еще не лизиро-

вали, то хлороформ разрушит клетки, мутная культура просвет­и Т⁴! о

леет и станет полупрозрачной. Б этом случае приступайте к эта­пу 9. Если же лизиса не произойдет, то иногда положение мож­но спасти, добавив к каждой культуре еще по 500 мл прогретой до 37 °С среды NZCYM. Инкубацию следует продолжить еще

2. 3 ч, встряхивая как можно интенсивнее.

9. Добавьте в каждую колбу по 10 мл хлороформа и продол­жайте инкубировать и встряхивать колбу еще 30 мин.

10. Переходите к очистке бактериофага X (этап 1, с. 92).

ИНДУКЦИЯ¹

Для получения бактериофага X из 2 л культуры индуцирован­ных бактерий выполните следующие операции.

1. Рассейте штрихом соответствующие лизогенные бактерии на две чашки со средой NZCYM. Одну из чашек проинкубируй­те при 30 °С, а другую — при 42 °С. Колонии должны вырасти только в той чашке, которая инкубируется при 30 °С.

2. Отберите уколом отдельную колонию из той чашки, кото­рая инкубировалась при 30 °С, и засейте ею 100 мл среды NZCYM в кол*8е на 500 мл. Проинкубируйте в течение ночи при 30 °С при сильной аэрации.

3. Определите Dm ночной культуры и засейте четыре пор­ции по 500 мл среды NZCYM, прогретой до 30 °С, таким коли­чеством ночной культуры, чтобы начальная оптическая плот­ность составляла 0,05.

4. Проинкубируйте смесь при 30 °С, интенсивно встряхивая ее, до тех пор, пока £>боо не достигнет 0,5. Важно индуцировать культуру непосредственно на этой стадии, так как при дальней­шем росте бактерий выход фага может оказаться значительно ниже.

5. Индуцируйте культуру, проинкубировав ее 15 мин в водя­ной бане на 45 °С при постоянном встряхивании.

6. Проинкубируйте индуцированную культуру при 38 °С еще в течение 2,5—5 ч при энергичном встряхивании.

7. В небольших пробах из этих культур проверьте развитие бактериофага. Для этого отберите в стеклянные пробирки по две пробы (по 1 мл) из каждой индуцированной культуры. В одну из пробирок добавьте 1—2 капли хлороформа. Обе про­бирки проинкубируйте в течение 5—10 мин при 37 °С, время от

¹ Pirrotta et al., 1971.

времени встряхивая. Сравните эти культуры, разглядывая их на просвет. Если лизоген индуцирован нормально, то обработан­ная хлороформом культура просветлеет, а необработанная оста­нется мутной. В таком случае переходите к этапу 8. Если же ли­зиса нет, то повторно проверьте используемый лизоген (этап 1) и начните эксперимент сначала.

8а. Если фаг несет ген S дикого типа, то лизис индуцирован­ных бактерий должен произойти спонтанно. В этом случае до­бавьте к каждой культуре по 10 мл хлороформа и продолжайте инкубировать их в течение еще 30 мин. Затем переходите к очи­стке бактериофага X (этап 1, с. 92).

86. Если фаг несет амбер-мутацию в гене S, то спонтанного- лизиса не произойдет. Частицы бактериофага останутся внутри бактерии-хозяина до тех пор, пока не будет добавлен хлороформ. Зараженные клетки можно сконцентрировать центрифугирова­нием и лизировать в небольшом объеме жидкости, чтобы не ра­ботать с большими объемами фаголизата.

Осадите бактерии центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 4°С. Ресуспендируйте осадок бактерий в буфере сле­дующего состава: 10 мМ трис-НС1, pH 7,4, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂. Добавляйте 10—20 мл этого буфера в расчете на 1 л исходной культуры.

Добавьте 10 капель хлороформа. Хорошо перемешайте с по­мощью смесителя Vortex и оставьте на 30 мин при комнатной температуре.

Чтобы удалить ДНК, освобождающуюся из лизировавших клеток, добавьте кристаллическую панкреатическую ДНКазу до конечной концентрации 0,2 мкг/мл и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре.

Удалите обломки клеток центрифугированием при 12 000 g в течение 15 мин. Соберите содержащую бактериофаг надоса­дочную жидкость. Переходите к очистке бактериофага X (этап 8, с. 93).

ОЧИСТКА БАКТЕРИОФАГА X^х

1. Охладите лизировавшие культуры до комнатной темпера­туры и добавьте панкреатическую ДНКазу и панкреатическую РНКазу, каждую до конечной концентрации I мкг/мл. Проинку­бируйте смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Для расщепления освободившихся из лизировавших бактерий нук­леиновых кислот, которые в противном случае могут быть за­хвачены частицами бактериофага, достаточно использовать не­очищенные, имеющиеся в продаже препараты этих ферментов.

2. Добавьте сухой хлористый натрий до конечной концентра­ции 1 М (29,2 г/500 мл культуры). Растворите, помешивая кру­говыми движениями. Оставьте стоять во льду на I ч.

¹ Yamamoto et al., 1970.

3. Удалите обломки клеток центрифугированием при 11 ООО g в течение 10 мин при 4°С. Слейте надосадочную жидкость в чистую колбу.

4. Добавьте сухой полиэтиленгликоль (ПЭГ 6000) до конеч­ной концентрации 10% (по объему) (50 г/500 мл надосадочной' жидкости). Растворите его при комнатной температуре, медлен­но перемешивая на магнитной мешалке.

Примечание. Некоторые исследователи предпочитают добав­лять полиэтиленгликоль одновременно с хлористым натрием (этап 2). В этом случае можно опустить стадию центрифугиро­вания (этап 3). Такой метод применяется, если бактериофаг размножается хорошо и титр его в исходной лизировавшей куль­туре выше 2 -10¹⁰ част./мл.

5. Охладите колбу в ледяной бане и оставьте там по край­ней мере на 1 ч, чтобы частицы бактериофага осели.

6. Соберите осевшие частицы бактериофага центрифугирова­нием при 11 000 g в течение 10 мин при 4^СС. Слейте надосадоч­ную жидкость и поставьте центрифужные стаканчики наклонно* Оставьте их в таком положении на 5 мин, чтобы оставшая­ся жидкость стекла с осадка. Отсосите эту жидкость пипет­кой.

7. Пользуясь пипеткой с широким отверстием с надетой на нее резиновой грушей, осторожно ресуспендируйте осадок бак­териофага в среде SM (8 мл на каждые 500 мл надосадочной жидкости). Тщательно обмойте стенки центрифужных стаканчи­ков, так как к ним прилипает осадок фага, особенно если стакан­чики старые.

8. Добавьте к суспензии бактериофага равный объем хлоро- фор ма и перемешайте с помощью смесителя Vortex в течение- 30 с. Разделите органическую и водную фазы центрифугирова­нием при 1600 g в течение 15 мин при 4°С. Соберите содержа­щую бактериофаг водную фазу.

9. Измерьте объем собранной жидкости и добавьте 0,5 г/мл сухого хлористого цезия. Осторожно перемешайте.

10. После того как хлористый цезий растворится, осторожна наслоите суспензию бактериофага на ступенчатый градиент хло­ристого цезия, заранее приготовленный в прозрачных центри­фужных пробирках для ротора Beckman SW41 или SW27 (или; аналогичных центрифуг) (табл. 3.1).

Ступенчатые градиенты можно приготовить, либо осторожна наслаивая последовательно друг на друга растворы с уменьшаю­щейся плотностью, либо подслаивая раствор большей плотности под предыдущий слой. Нанесите метку снаружи пробирки на уровне границы между слоем с р = 1,50 г/мл и слоем с р= 1,45 г/мл (рис. 3.1).

11. Отцентрифугируйте препарат в роторе SW41 или SW2T при 22 000 об/мин в течение 2 ч при 4°С.