т

4

-г

Ь

“I 1 1 1 1 1 г~

а 9 ;0 м 12 13 14

П 1 1 1 1 1 1 Г Н 1 Т Г"

16 I? (0 19 20 21 22 23 24 25 26 2Г

Kb

"Т"

2

т

6

to®. I-

NiiF A W В

I - М

С

Nu3 PIT D Е Fi 2 J

Г

н

M L

и

7ТТ

|i

11=3

од

и о Е о

о

I I

С -3

a > т £-

in

” \

V

(Ь

а

а

х

с

Cl

Ж

с

Q.

ъс

о

>

<1

и tr: г: t=d ^ >•-

с j СГ _ ₀ £

</i ^ > О ^ о. п

(Л(Л< и1Лх Л

» н

СТ¹

аз ^

—t *-* ич б” ^ ^5

Si

- UJ

о

XI

Дот Bcti

л L

Фермэнг Вставка/замещение

Есо ЧГ

Замещение

ioc5

с

\\\\\\\\\\\\\>

СП

о

о

Есс RI

0

Р

EcoRI

Soil

Замещение

Xbal

Вставка

2,82 0

Xbo I Xbol

Xnc I

Вставка

EcoRI/So^; Г

Замещение

Ч

21,4

EcoRI

EcoRI-'Xhol Замещение

Xbo I/Soil Замещение

17.4

25)

EcoRI

16,46

sss z: I

Xbc I

.Xbo J /Soi I Замещение

XboT/SoiI Замещение

.42

XbQ t

Харон ЗА

Общая длина: 48,3 kb , , _ftA .. < ~

Генетические маркеры: Aam32, BamI, Iac+, imm80. Нуждается в бактерии-хо­зяине с супрессором sull. Образует голубые бляшки в чашках с Xgal

и

u.

Ф i ■ f i м' * и I R⁽ f. i н к _ri .4 м f ■ щ' * н и * ■

... - ( M Л К и M M . 20,1

XbO I &< Т..ИК:. 4\\\\\\\\\\^VT

• r ■-; <■ r , i

Xapoii 4 A

Общая длина: 45,4 kb

Генетические маркеры: A am 32, Baml, lac5, bio256, VKH54, VNIN5, ^80 QSR Образует голубые бляшки n чашках с Xgal. Нуждается в бактерин-хозяинс с

супрессором suIII

Трудности, связанные со второй проблемой, можно свести к минимуму, если: с космидным вектором лигировать фрагменты эукариотической ДНК определенной длины (30—45 kb). Встраи­вание в одну космиду двух или более таких фрагментов приве­дет к образованию молекулы, которая окажется слишком боль­шой; чтобы она могла упаковаться в частицу бактериофага X.

Недавно был описан другой метод клонирования в космидах, обходящий первые две из указанных трудностей (Ish-Horowicz, Burke, 1981). В соответствии с предложенной процедурой, кото­рая была разработана для вектора pJB8 и схематически изобра­жена на рис. 1.10, препарат космидного вектора разделяют на две порции, каждую из которых расщепляют своим рестрикти- рующим ферментом; первый из этих ферментов делает разрыв с одной стороны от последовательности cos, а второй —с другой стороны от этой последовательности. Получающиеся в резуль­тате линейные молекулы ДНК дефосфорилируют, обрабатывая щелочной фосфатазой. Именно это дефосфорилирование пред­отвращает образование при лигировании тандемов векторов и снижает фон бактериальных колоний, содержащих космиды без

вставок. Затем обе дефосфорилированные ДНК расщепляют рестриктазой BamHI и смешивают их, чтобы получить липкие концы, которые можно лигировать с фрагментами эукариотиче­ской ДНК, полученными при частичном расщеплении рестрик­тазой Mbol или Sau3A с последующим дефосфорилированием. При такой процедуре получается лишь один тип способных упа­ковываться молекул, которые содержат фрагмент с «левым» сайтом cos, вставку длиной 32—42 kb и фрагмент с «правым» сайтом cos. Вектор pJB8 обладает тем дополнительным преиму­ществом, что он содержит два сайта для EcoRI, расположен­ных с обеих сторон от BamHI-сайта недалеко от него. Это поз­воляет почти точно вырезать встроенную ДНК. Методику эту, однако, легко приспособить и к другим существующим космид­ным векторам (с. 68—69). Эффективность метода достаточно высока, и при его использовании получают более 5-10⁵ клонов

Xbo I / Hmd Ш

EcoRI /Soil

EcoRI /Xho I

Sst I/Sol I

Xbo I /Sol I

Sol I/Xhol

Sst I/Xho I

Xbol/Xhol

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

*2',64

Sst I

8.64

18,4 7

EcoRI 18,7 3

EcoRI

17,37

’

Ssf I

17,63

SstI

17,72

УЬа I

13,46

Xbol

13.71

Ц

Xbol

5,47

Soli

5,73

Xho I

4,37

•Soli

0.46

Soli 5.37 *

^c-g! I Xho I

4.63

C.7I

p-

Xhol

Харон 17

Общая длина: 46,4 kb

Генетические маркеры: Iac5, NIN5, clam, Fee-. Образует голубые бляшки в чашках с Xgal. Образует лизогены в бак- териях-хозяевах с супрессором sull или suIII Литература: Williams В. G., Blattner F. R., 1979, J. Virol., 29, 555

НтбШ

4.72

Hind 12

— г

О .V AS С 1 1

Ф(;р М ("*Н т

. i Г.' л I ИИ< '

м;н> I’M; г** *

; а

1V- .г Hi

Харои 20

Общая длина: 40,36 kb

”1—

?*>

-г~

СП

'Т~

2Q

—г^-

?.9

~г~

I

П—

Ч-j

~Г"

' * I .

г j

г

ЬЧ.'О

■► К L~S

К

4v;

ш

□

г'^^{: 11} (минимум!

I I ОЛ j/^ СИ И ■-

catn jh :..'vC г у. и г .:/■/

L ■ к он о:: h j

' I

ж

^r' I - ^

зд

И ,n С

‘‘^sl

4^

!^u^r ►J n I

’4'V

ч - ■ *, ^

^ 5 о с

1 ' ■''

s

Генетические маркеры: Ы007, NIN5, imm434 Литература: Williams В., Blattner F., 1979, J. Virol., 29, 555

4- К/

I I I I I ! I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ?—

Kb I 2 3 4 5 6 7 8 S *0 I' 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26

cos L Nul

W B'

I i

"Ё c.. m x

Nu3 FE

D E FI 2 t V G

i I I 1 I I

fi

M

К I

tea

л:

a

viii^SS iiif

с

Cl

tn (л > о и a n л ел <t о со х гп

LmJ ^

CQ

"И

Я tn ТЗ 1/>

£ сл = ю

Wom.

Earn

b 1007

сс

о

О

Т

в

"'О

с

Фермент Встав ка-замещение

Hind Ж

Вставка

(максимум) 91 о(^мин)

HmdIH HindHI

EcoRI

Вставка

9,1 0

EcoRI EcoRI

Sol I

Вставка

Xhol

Вставка

EcoRI / HindШ

Ktndffi/ Sol I

Hind Ш /Xho I

EcoRI/Sal I

EcoRI/XhoI

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

11,05 К

=1 Р-

EcoRI Hind Ш 19.15

Hind Ш

15,25

Hmd Ж

21,08

EcoRI

17.19

Eco RI

Xhol/Satl

Замещение

Харон 21A

Общая длина: 41,7 kb

Генетические маркеры: Wam403, EamllOO, imro80, Vbl007, VKH53, VKH52, VNIN5. Нуждается в бактерии-хозяине с супресоором supE или supF

т

H

Soli

2.26

Xhol

4,19

Xhol

8J

Soli

13,0

Xhol

SolX

нипом Л?^аАт«г п^{ЛаТТНер и Д}Р,\ ^{Заявка на} систему вектор — хозяин для кло­нирования ДНК. Приложение IX. Данные о Хароне 21А

^Этот бактериофаг широко используется в качестве вектора для

польчов_Я^^апп^^НТ0В' 9" ^содеР^жит амбер-мутации, и потому его удобно ис-

ользовать при рекомбинационном скрининге с плазмидой nVX

Фермент

bar- I

Н I Г: :"1 LC

(штамм 222 11

(штамм 22/01

'оа'

ЕГ с о R Г ■' В а Т' Т (Ш тамм 222 1)

EcoRI ' Barr.Т (штамм 2270)

H i n d Ш 'Soil

EcoRI/Soir (штамм 2221]

EcoRI .' S о 11 (штамм 2270)

EcoRI/Xhpt

(штамм 2221)

EcoRT/Xhot (штамм 2270)

SolI/XhnT

Вс га в ка/за мощен и Замещение

Вс ганка

Замещение

Вс танка

Замещение

Замещение

Знм^щеии!-'

Замещение

Замещение-

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

зяиршр.ниа

■ j ■ 2 с-

' ' t. (Г _

¹Я ^г' ь

'°~[=

На”"-

EcoRI

Во- I

3,86

Sal I 5/5

Soil

13.2'

EcoRI Sol Z

4.96

Xhc I

EcoRI Hpo I нра I Bell Sal I Sui I Xho I Bom I Hpo I Bgl IT PvvJ I Bgl Л Ava I Bgll Bgl E Hpo I Hpo I Sma I SstI Bell Bel 3 Bell R-конец

282T0

28280 2 6 6 8 С 29200 2 924 С 2 9 74 С 30000

з;соо

31760 32 220 32280 325 О С 32620 33160 332 20 34020 34240 34300 34630 35310 380£0 39650 402.30

(3,61

EcoRI Xhol

~1 i 1 1 1

12 13 14 ;5 16

-i 1 1 1 1 1 1 i 1 1—

-B i9 20 2i 23 24 2b 26 27

cos L

N u; д w В

: I

н

М L К I

IS v.\SSSS

аса ■ ta"t=f 0

-т. S?r.°£ "6^ m S

x

e и £ a

> a о ^a

о — — “ CD £D

D ^ Cl >

‘r- a.

u

CD

О

a.

X

a

al.

a

un </> > O ^ Q. r? <1

X

u CL Ul

■[

Ы007

P

blC07

Фермент

Bam I

Hind Ж

Вставка/замещение

Замещение

Замещение

(максимум) I9j 10 =1

Bern I

ilj67

Hmd Ж

EcoRI

Замещение

17,46

=1

EcoRI

Soil

Xhol

EcoRI / Sol I

HindlH/Soil

HindHI /Xhol

EcoRI /Sail

EcoRI /Xho I

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

и

12,18

Soli

Я, 6 7

Xho I

20,24

EcoRI

Ц

17,05

Hmd ДС !7_%31

Hind Ж

18,93

А

EcoRI

19.24

EcoRI

Sail / Xho I

Харон 30

Общая длина: 46,76 kb

Замещение

12,43

Soil

■М ГМ-?)

■ i а м < ■ щ * ■ м и f ■

■j -

.v- ■ ■ Вст анка

:'Л.' ,\^гс I Замещение

,1709

Общая длина: 43,25 kb

г¹'Г i

Н 1 г

2 3 4

-! Г

D 6

П г^-

7 Ь

"I 1 1 1 1 1 1 1 1 ! Г

.0 II :2 13 14 15 16 17 18 19 2 С

Л' Б

И

■ ^ г ^ri -¹ Г £ т

:/ L К I I ! I I ■

I I

— I'l т-р. _L_

т: -

о

Ck

Cl -

г а-

I ;

! I

:Tj

J. *

¹ M ¹! ! n⁴!

cj : — * - с з ■ • " - .-J F4

Tr o ■; :■ v

^ .j:¹

(sr: xi - 2)

UJ

rj

OeiiMeur Вс тавкн /^ам^щониг! - . „ ,

_ . _ (максимум) 2ч_}[

¹ ■' ■' ^’ Замещение |

EcoRI

Н:ПС11П

замещение

Вс гп I

Замощение

В с т а ь к а

Sa!

j. 1

Замещение

Go. i .'Xhol

Замещение

&L47.1

Общая длина: 40,6 kb

Генетические маркеры: (srUl-2)v, imm434 cl-, NIN5, chiA 131

т

Lи

Ф'' f I М i ‘ Н 1

Eco RI

д_а | j .'iaMi чцг 'н ■

DC I HRK.i. 'KiMf 'Ц( ■ н и (■

^<:М• I;.-. НИ>

(1 К i И М * Vi • \$

f

tг-, t,'

ss

Xh₀ I

B<" 1 IM И I

.coRl /$а: I

,;c RI/ Xho I

Sst I / So: I

Sst I / Xhol

..iiiMVlV 'НИ¹

Замещении

Замещение;

3

Eo- -:

^CO ^ д

q ^4

ss^

Sst 7

2C^

Sst J

Xsep6-1ae5

Общая длина: 44,3 kb

Генетические маркеры: lac5, iinm21 ts, NIK5

Литература: E, Meyerowitz, A. Rambach, неопубликованные данные

^ _{( т} 1 1 1 г

£0 26 V7 ?8 29 30 31

' т— \ 1 1 [—

32 33 3 4 3S 36

■1

36

—г~

~~1—

•К;

-г г^-

4; 40

“I г

1 Г

"t I

4~

j - I < " ' ^{4 k} ’ ' ' ► «

- * Ct -i _n U •

V •, 1Л ¹ и > •

red ^K

e*o qan- гЩ rj. 4

rex

^ _a (Г . Ij yu у O' J CJ' о ^ t ^ O

° r IIJ a ^{L ai} ^ ¹ x < 'It tu - r r _L,, О > _T,

TJ r r I i-'

ac5

or

a

,0 ^{; J}cc

-«- 'J о ■ u - UJ

irr.nn 21 f ь

NIN 5 _r J L

I м и и л м у м)

■oRI

Погюжпнио :аи I OB pi ч: т рикциК

L- конец

Чу; П

Bani I

Kpn I Kpn I

E'coRI

4 .^r0 b560

■ .'4 3ч¹ .80ЬС '9940

Q *

,34

¥

л u;

t ¹

. ._ \ • *

_hJ i '■i 3 !

v-₀:

nq u H,} Li 4 kohol;

^J.;, ’

j - ^ i

¹: ⁷ К .. V’ ^J'V- 4 ; s

8,14

<h0

:n a t i

6,34

F=

Xhol

Примечание: Этот вектор интенсивно использовали Хогнесс и др. при созда­нии библиотек ДНК Drosophila. Существует производный фаг (Asep6-lac5A), который содержит амбер-мутации в генах Л и В (D. Goldberg, неопубликован- г^Л+^аИИЫС ^^{скомбш1а11ТЬ1} обоих фагов необходимо выращивать на хозяевах

к ^г

i л *

т~

г

~Т-

3

"Г

4

Т“

5

т

7

Т

II

-Г"

12

кь

I

6

~г

8

9

10

т~

14

Т“

15

“Г"

Т-

17

18

"I г~

19 20

-Т 1 г*

22 23 24

cos L

Nu3

Ы80

Фермент Вставка/замощение . Baml Замещение

XI059

Общая длина: 44,0 kb

Генетические маркеры: h^sBaml°bl89 (int29, NIN L44, с1857, pad29) Д

(int-cIII) КН54 sRl 4° NIN5 chi3

Замещение «балластного» фрагмента (содержащего гены red и gam) чуже­родной ДНК приводит к изменению фенотипа фага оо Spi⁺ на Spi"

Литература: Karn et al._t Ргос. Natl. Acad. Sci. US, 71, 5172, 1980

Карта фага /Л 059

Это вектор для клонирования больших BamHI-фрагментов, в котором замещение «балластного» фрагмента (содержащего гены red и gam) чуже­родной ДНК приводит к изменению фенотипа фага со Spi⁺ на Spi“. Вектор содержит область начала репликации ДНК плазмиды pBR322, что позволяет ему размножаться в лизогенных пег фагу X клетках в виде плазмиды (фаз-

на 1 мкг встраиваемой ДНК D. melanogaster (Ish-Horowicz, Burke, 1981).

Третья проблема, связанная с трудностью проверки большого числа бактериальных колоний на присутствие искомых последо­вательностей ДНК, была разрешена после разработки методики

-| 1 1 1 1 т г"

25 26 27 28 29 30 3'

~| 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 г-

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 43 4T^J

y-j

о£Г О о оо о ° Е о m с/j сп £

о -L X. Л.

а"вз^н"«н^‘

С О — -J — О — — ОТ - — „

t Q.C7‘> ^T:J^^T:,0C7‘>O^k‘0¹O^aQ-f^: ^

°itDo_ ?^ш^-ш<сотохХ(7|

CD XXX ш

int 29

-d t

NIN

L44

D—Г

amp¹

colicin

pod 29

Qlt

, " KH54

CD С

NIN5

(максимум) 24,4 6,30 (минимум)

—q

■ I I I I " I I " т

25 26 27 28 29 30 31

I ’“I I ¹ I Г—I 1 1 г Г I Т I 1 Г I ~Т г

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 КЬ

ott

red К е*о дот _Го(

cos R

1Л

X ° ° ^ о О °

о. > ¹^_гУ^^С7'>0'о'о а о.р ^

I т а. £^тЕ ?m<itD(E

XIX ы ^ш

о

CD

т

•о

int 29

N1NL44

F ^Н

t -D

0. С

<30 ±

1

-d

ITT

NINL44

HI—EZ

о о

(Л1Л

£Г

О

о

^м в

О с

т -F

ТТ

о

со

тг 29

]

)

сг.

о

о

Ё

О

СП

СИ}

КН54

NIN5

3

(максимум! 24,4

Ват I

6,30 (минимум)

р=э—

Ват 1

плазмиды pBR322, с тем чтобы устранить трудности, обусловленные гибриди­зацией нерекомбинантных фагов (см. карту фага Я1059). Во-вторых, образо­вавшийся «балластный» BamHI-фрагмент инвертирован и дуплицирован, и тем самым инактивирован ген int (ср. карты фагов Х1059 и XBF101). Ген int инактивируют для того, чтобы исключить спонтанный фон фагов Spi“ в пре­парате родительского фага (см. карту фага Х1059). Препараты этого фага следует выращивать на штамме KR0 гесА~, чтобы предотвратить гомологич­ный, но неравный кроссинговер между дуплицированными BamHI-фрагмен­тами.

ценным является создание библиотеки ДНК человека в косми- дах, можно судить хотя бы по тому, что таким образом удалось выделить ряд перекрывающихся фрагментов ДНК, содержащих кластеры генов ^-глобина (Grosveld et al., 1981) и генов ia-гло­бина (Р. СЬагпеу, неопубликованные данные). Последние из этих рекомбинантов, выделенные с использованием самых совре­менных методов клонирования в космидах, оказались стабиль­ными при размножении в бактериях.

В заключение можно сказать, что клонирование в космидах разработано настолько хорошо, что в некоторых случаях явля­ется наилучшим из всех известных методов (например, при вы-

6—164

Сайт

|

оп I

Лигирование

/w^AЛллллллллллл/^ллллллл Высокомолекулярная эукариотическая

ДНК

Частичное расщепление рестри к тирующей эндонуклеазой

/WV'/WVWWV ЛЛЛЛ ЛЛЛЛЛ/ A/VWWW

1

t

A/VWV^VV\AA/VVWv^VWVVW'|^fWVW\yj

iff» i cm—(—*-hzzh-

Заражение клеток E. coli

| ^ Устойчивые к ампициллину трансформанты

Рис. 1.9. Клонирование в космидах.

делении больших генов или для проведения экспериментов по прослеживанию последовательности в хромосомах). Тем не ме­нее бактериофаг Я, по-видимому, и впредь будет самым лучшим вектором для рутинного создания библиотек эукариотических ДНК благодаря своей высокой эффективности и большей уни-

зерсальности.

67

Hind III и фосфатаза

ОН [ cos 3

I—г^он

Sol BamHI

Sal I и фосфатаза Hmd Ш fj-4~cos 1—

BamHI

I

I

Bam HI

OH l~cos"l

Г

Sal

n

| Bam HI

Hind Щ

L

OH OH

—Tcos V-OH

Смешивание

Лигирование с эукариотической ДНК, которая была подвергнута частичном/ расщеплению Mbol илиЗаиЗА и дефосфорилирована

Hind Ш

ОН

-Tcos)

Г

Sol

—'Аллллл/ууу

37- 50 kb

J

-]

Упаковка in vitro

Ряс. 1.10. Эффективное клонирование в космидах (Ish-Horowicz, Burke, 1981)»

БАКТЕРИОФАГИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНУЮ ДНК

Из векторов-бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК, наиболее совершенными в настоящее время являются век­торы на основе фага М13. Последний представляет собой ните­видный бактериофаг с кольцевой замкнутой ДНК длиной около 6500 нуклеотидов (Denhardt et al., 1978). Фаг М13 адсорбирует­ся на F-пилях Е. coli и потому способен заражать лишь мужские клетки бактерий (штаммы F' или Hfr). После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочеч­ную репликативную форму (РФ), которую можно выделить из клеток и использовать в качестве вектора для клонирования

б*

Размер: 5,4 kb

Репликон: ColEl, релаксированный Селективный маркер: Ашр^г Единичные сайты: BamHI, EcoRI, Sail Литература: Ish-Horowicz, Burke, 1981 Примечание: Космидный вектор, который исполь­зуется для клонирования больших £coRI- или BamHI-фрагментов с помощью методики, разрабо­танной Иш-Горовицем и Берке (Ish-Horowicz, Burke, 1981)

MUA-3

Размер: 4,7 kb

Репликон: ColEl, релакеированный Селективный маркер: Tet^r Единичные сайты: PstI, EcoRI, Clal Литература: Meyerowitz et al., 1980 Примечание: Космидный вектор, пригодный для

клонирования больших -фрагментов

Kosl

Размер: 4,0 kb

Репликон: ColEl, релаксированный Селективный маркер: Tet^r

Единичные сайты: EcoRI, Bglll, PstI, Hindlll, Clal Литература: P. F. R. Little, неопубликованные данные

Примечание: Космидный вектор, пригодный для клонирования больших рес­трикционных фрагментов в сайте Bglll. Инвертированный повтор около сайта £coRI приводит к тому, что у некоторой доли молекул (<5%) в этой области оказываются небольшие делеции

двухцепочечной ДНК. После того как в клетке накапливается 100—200 копий РФ, синтез ДНК фага М13 становится асиммет­ричным и образуются большие количества лишь одной из двух цепей ДНК, а именно той, которая в конце концов войдет в сос­тав зрелых фаговых частиц. Эти частицы непрерывно выделя­ются зараженными клетками. Хотя клетки при заражении фагом М13 не погибают, их рост несколько подавляется, и потому этот вирус образует на бактериальном газоне мутные бляшки.

Основное преимущество фага М13 как вектора заключается в том, что выделяемые клеткой частицы бактериофага содержат одноцепочечную ДНК, гомологичную одной из двух комплемен­тарных цепей клонируемой ДНК. Такую ДНК можно использо­вать в качестве матрицы для определения последовательности ДНК по методу Сэнгера с использованием дидезоксинуклеоти- дов (Sanger et al., 1977). Разработаны векторы М13 и специ­фические ДНК-затравки (см. ниже), позволяющие провести сек-

венирование из отдельного клона последовательности до 350 ос­нований (Sanger et al., 1977; Anderson et al., 1980). Быстрое секвенирование длинных участков ДНК удается осуществить пу­тем секвенирования перекрывающихся клонированных фрагмен­тов (Gingeras et al., 1979; Anderson et al., 1981). Кроме того, клоны M13 можно использовать как источник одноцепочечных ДНК-зондов для отбора РНК, а также в качестве субстрата при мутагенезе in vitro (Itakura, Riggs, 1980).

Основная трудность при клонировании в М13 связана с не­стабильностью больших вставок ДНК. Как правило, клониро­ванные последовательности длиной более 1000 нуклеотидов не­стабильны, и при размножении такого бактериофага появляются делеции. Однако вставки длиной 300—400 нуклеотидов оказы­ваются достаточно стабильными, чтобы их можно было приме­нять в указанных выше целях.

Векторы на основе бактериофага М13

За исключением участка длиной 507 нуклеотидов, названного межгенной последовательностью (МП), весь геном фага М13 содержит генетическую информацию, необходимую для реплика­ции этого вируса. Показано, что в участок МП можно встраи­вать чужеродную ДНК, и это не влияет на жизнеспособность фага* В производных М13, сконструированных для использова­ния в качестве клонирующих переносчиков, в эту область встрое­ны последовательности двух типов.

1. Первая из них представляет собой фрагмент /ас-оперона Е. coli, содержащий регуляторную область и последовательность

Таблица 1.2. Векторы М13 и используемые для клонирования сайты

Вектор

Сайты для клонирования

Источник данных

гпр5

тр7

тр8

тр9

EcoRV)

EcoR I -Mindll I-£coRI²>

EcoRl-BamHl-Sall-Pstl-Sall-BamHl,

E coR I

EcoRl-Smal-BamWl-Sall-Pstl-Hindlll HindUbPstl-Sall-BamHl-Smal-EcoRl³>

Gronenborn, Messing, 1978 J. Messing, личное сообще­ние

Messing et al., 1981

J. Messing, личное сообще­ние

J. Messing, личное сообще­ние

') Этот сайт появился не при включении линкерной последовательности, а в резуль­тате мутации, индуцировавшей сайт для £coRI в пятом кодоне гена $-галактозндазы.

^а) Структура сайта для клонирования в векторе шр5 сложнее, чем здесь показано. Этот сайт состоит из нескольких линкеров, расположенных тандемно и ограниченных С QtSeHX сторон по крайней мере двумя линкерами fcoRI.

³) В векторе шр9 полилинкер находится в ориентации, противоположной его ориен­тации в тр8.

MI3 тр8 . **

ATGACCAT GATTACGAATT CCCGGGGATCC

I I

EcoRI , Smal ,

Xmal , BomHI _t

GTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCA

¹—-— ¹ PstI Hind nt

Acc I

Hmc П

Рис. 1.11. Этот клонирующий вектор (mp8) создан Д. Мессингом на основе фага М13. Он содержит полилинкер, и потому в нем можно клонировать раз­нообразные фрагменты ДНК, полученные при расщеплении рестриктирующими эндонуклеазами. Вставка в полилинкер фрагмента чужеродной ДНК инакти­вирует ген р-галактозидазы, что позволяет очень просто выявлять те фаги, которые содержат такие вставки (по инактивации a-комплементации).

гана Z, которая кодирует первые 146 аминокислот р-галактози- дазы. Образуемая в зараженных клетках аминоконцевая часть р-галактозидазы способна комплементировать («а-комплемента- ция») с дефектной р-галактозидазой, которая кодируется мутант­ным геном в F-факторе клетки-хозяина. В результате такой комплементации получается активная р-галактозидаза, и если фаг и клетки выращивают в присутствии индуктора изопропил- тиогалактозида (IPTG) и хромогенного субстрата Xgal, то бляшки приобретают голубую окраску.

2. Последовательность второго типа представляет собой не­большой фрагмент ДНК (полилинкер), встроенный в «амино­концевую» часть гена р-галактозидазы и содержащий исполь­зуемые для клонирования единичные сайты для нескольких ре- 'Стриктаз. Эта вставка не влияет на способность образующегося фрагмента р-галактозидазы комплементировать с мутантной р-галактозидазой клетки. Однако встраивание в эту область до­полнительного фрагмента ДНК нарушает комплементацию. Со­держащие такой дополнительный фрагмент фаги образуют на среде с IPTG и Xgal бесцветные бляшки. Схема канонического клонирующего вектора М13 приведена на рис. 1.11. Клонирую­щие векторы М13 различаются в основном находящимися в по­лилинкере рестрикционными сайтами. В табл. 1.2 перечислены сайты для клонирования, содержащиеся в используемых в на­стоящее время векторах.

Специфические небольшие фрагменты ДНК, которые исполь­зуются в качестве затравок при секвенировании клонированных ДНК, теперь субклонируют в плазмидах (Anderson et al., 1980) или синтезируют химическим путем (Rothstein et al., 1980), и оик имеются в продаже. Эти затравки гомологичны области ге­на ,р-галактозидазы, расположенной в векторе М13 непосредст­венно рядом с областью полилинкера. .

выводы

Как уже говорилось в начале этой главы, четыре типа век­торов— плазмиды, бактериофаг X, космиды и бактериофаг М 13— обладают особыми биологическими и физическими свой­ствами, позволяющими использовать их для решения различных задач клонирования. Отличительные свойства и основные приме­нения каждого из этих четырех типов векторов суммированы в табл. 1.3.

Космиды и различные штаммы бактериофага К способны включать большие фрагменты чужеродной ДНК, и потому они используются как векторы для конструирования и размножения библиотек геномных ДНК эукариот. Однако они довольно не­удобны в качестве векторов для работы с небольшими фрагмен­тами ДНК и для их подробного анализа и, по крайней мере в

настоящее время, не подходят для создания библиотек кДНК-

Векторы для клонирования, содержащие одноцепочечнук> ДНК, используются главным образом при получении матриц для секвенирования методом терминирования цепей по Сэнгеру с ис­пользованием дидезоксинуклеотидов и как источник отдельных цепей ДНК для гибридизации нуклеиновых кислот. Относитель­ная нестабильность вставок ДНК размером 1 kb не позволяет использовать одноцепочечные бактериофаги для большинства других целей.

Плазмиды широко используются в самых разнообразных, процедурах клонирования. Они способны включать фрагмента) ДНК средних размеров, что позволяет применять такие векторы? для субклонирования библиотек геномных ДНК, созданных на основе космид или бактериофага Я. Плазмиды содержат много удобных сайтов рестрикции, что неоценимо при создании новых конструкций ДНК. Это единственные векторы, удобные для кло^ нирования кДНК. Наконец, создано большое число плазмида к которых кодирующие участки клонируемой ДНК можно постам вить под контроль очень эффективных бактериальных промото­ров. Такие векторы, свойства которых подробно описаны в гл. 12, используют для анализа экспрессии чужеродных генов в Е. coli■

В Приложении В приведен список использованных в этом руководстве бактериальных штаммов.