EcoRI

5^f—►З¹

EcoRI

ОН

ОН

Фосфатаза

он-

ОМ-

ОН

он

/

Не может вновь замыкаться в кольцо

EcoRI EcoRI

1 I

Чужеродная ДНК

5'—► 3’

EcoRt

р

I

ДНК-лигаза

он он

он-

он

он-

он

4-

»

Низкая эффективность трансформации

)

Высокая эффективность трансформаций ^

Рис. 1.4, Использование фосфатазы для предотвращения повторного замыка­ния в кольцо ДНК вектора.

плазмиды, обработав ее бактериальной щелочной фосфатазой или фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота (Seeburg et al.» 1977; Ulrich et al., 1977). В результате ни одна из цепей дуплекса не сможет образовать фосфодиэфирной связи, и в то же время сохранивший 5'-концевые фосфаты сегмент чужерод­ной ДНК можно эффективно лигировать с такой дефосфорили- рованной плазмидной ДНК- В результате образуется открытая кольцевая молекула, содержащая два одноцепочечных разрыва (рис. 1.4). Так как эффективность трансформации колкпеяпй ДНК (даже содержащей одноцепочечные разрывы) гораздо вы-

ше, чем линейной плазмидной ДНК, то большинство трансфор- 'мантов будет содержать рекомбинантные плазмиды. Методика обработки плазмидной ДНК фосфатазой приведена на с. 141.

Сложности, возникающие при клонировании в плазмидах больших фрагментов ДНК

Соотношение трансформантов, содержащих рекомбинантные

плазмиды, и трансформантов с повторно замкнутым в кольцо

вектором может зависеть также от размера встраиваемой чуже­родной ДНК. Как правило, чем больше вставка чужеродной ДНК, тем ниже эффективность трансформации. Поэтому при клонировании больших фрагментов ДНК (>10 kb) особенно важно принять все возможные меры для снижения повторного замыкания в кольцо молекул вектора. Но и в этом случае фон оказывается довольно высоким, и обычно для выявления реком­бинантных трансформантов необходимо использовать гибриди­зацию in situ (Grunstein, Hogness, 1975; Hanahan, Meselson, 1980).

БАКТЕРИОФАГ X

С тех пор как впервые было показано, что бактериофаг X можно использовать в качестве вектора (Murray, Murray, 1974; Rambach, Tiollais, 1974; Thomas et al., 1974), на его основе скон­струировано большое число разнообразных векторов (см. обзор Williams, Blattner, 1980). Чтобы эффективно использовать эти векторы, необходимо знать основы молекулярной биологии бак­териофага К (более исчерпывающую информацию см. в работах Herskowitz, 1973; Hendrix et al., 1982).

^Бактериофаг А, представляет собой вирус, содержащий двух­цепочечную ДНК. Его геном имеет размер около 50 kb (рис. 1.5). ДНК в частицах бактериофага Я, находится в виде линейных двухцепочечных молекул с одноцепочечными компле­ментарными концами длиной по 12 нуклеотидов (липкие концы). Вскоре после проникновения в бактерию-хозяина эти концы сли­паются, ДНК замыкается в кольцо и в течение ранней стадии инфекции транскрибируется уже как кольцевая молекула. В хо­де этой стадии происходит выбор одного из двух альтернативных путей репликации вируса (рис. 1.6). 1. При литическом развитии кольцевая ДНК многократно реплицируется в клетке, синтези­руются большие количества продуктов генов бактериофага, об­разуются и созревают частицы вирусного потомства. В конце концов клетка лизируется, высвобождая много новых инфекци­онных вирусных частиц. 2. При лизогенном же развитии геном инфицирующего бактериофага встраивается в ДНК бактерии-

'паковка

ДИК

Упаковка

Дик

Синтез компонентов головки и сборка

Синтез компонентов хвостового отростка и сборка

Область Ь₂, функция неизвестна

1евый конец

;os i

in

1.

о

kb I

t’ И

O'

ию х

I г "I

Ю

12

° У ь ° ^и

* ^ ГЗ Ci

<Л f . г ^г

^м ^ OJ * *■

13

14

15 16 17 18

а >

х а_

о

а

Г

19

I

20 2f 22

а

а

ж

□

о

>

<1

t=j tn — _ о

25 26 27 28

I i

- сг

" о ^я <л о а

Рис. 1.5. Физическая и генетическая карты бактериофага к дикого типа. Ввер- тического и лизогенного путей развития. Далее приведена генетическая карта, функции каждого из этих генов см. в работе Hendrix et al., 1982). Внизу при- молекулы в тысячах пар оснований (kb). Отмечены сайты расщепления рес- работе Уильямса и Блаттнера (Williams, Blattner, 1980).

хозяина, последовательно реплицируется и передается клеткам- потомкам как обычный хромосомный ген.

Ниже подробнее описаны те гены и их продукты, которые участвуют в этих двух путях развития бактериофага X.

Литический цикл

Немедленная ранняя транскрипция

В начале инфекции транскрипция инициируется на двух про­моторах, p_L и рку которые расположены непосредственно слева и справа от гена с\ (кодирующего репрессор) (рис. 1.7). Терми- нация получающихся при этом «немедленных ранних» РНК про­исходит в конце генов N и его соответственно в сайтах t_L и £ri, хотя рост некоторых правосторонних транскриптов продолжает­ся и далее, через гены О и Р (которые кодируют белки, участ­вующие в репликации ДНК) и заканчивается в сайте t_R2. Лево­сторонний транскрипт кодирует белок N, действие которого не­обходимо для следующей стадии инфекции.

Задержанная ранняя транскрипция

Белок N нейтрализует активность фактора терминации р клетки-хозяина и позволяет транскрипции пройти через ранние терминаторы tu tri и tR2 в остальную область ранних генов. По-

п

г

L

о

Правый

конец

cosR

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Kb

А1\ Г

tv

1

/'.Г ¹ А" "Г

Л}

ей

о. о T lD !

X X

£

о

СО

CD

а

тз

о:

о

ш

ху указано обычное расположение генов, кодирующих различные функции ли­на которой показано положение отдельных генов бактериофага X (описание ведена физическая карта ДИК фага а. Указаны расстояния от левого конца триктирующими эндонуклеазами. Подробная карта рестрикции приведена в

этому белок N является положительным регуляторным элемен­том, активность которого необходима для литического развитии бактериофага, обладающего сайтом tr₂. Мутанты N~ могут, однако, расти (хотя и относительно плохо), если в результате делеции у них удален сайт Такие фаги называют мутантами nin (^-independent — N-независимыми).

Репликация ДНК

В течение ранней стадии инфекции кольцевая ДНК фага К реплицируется двунаправленно в виде структур Кэрнса (млн 0-форм). Эта репликация начинается в единственной точке ини­циации репликации (оп) (рис. 1.7), для активации которой не­обходимы два кодируемых вирусом белка — О и Р. Позднее начинается репликация по типу катящегося кольца (чем опреде­ляется переход от структур Кэрнса к катящемуся кольцу — неизвестно) и образуются катенированные линейные молекулы ДНК. В процессе упаковки ДНК продукт гена А фага К рас­щепляет эти катенаты в сайтах cosL и cosR, в результате чего получаются те линейные молекулы ДНК единичной длины с липкими концами, которые и оказываются в зрелых частицах бактериофага.

Поздняя транскрипция

Начинающийся с р^ ранний транскрипт кодирует белок его. Накопившись в процессе инфекции, этот белок связывается с оl и Or, подавляет присоединение РНК-полимеразы и тем са-