Глава 8

ВВЕДЕНИЕ ДНК ПЛАЗМИД И БАКТЕРИОФАГА X В КЛЕТКИ £. coli

Главный этап в молекулярном клонировании — введе­ние рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки. Рань­ше этот процесс был малоэффективным и плохо воспроиз­водимым. Теперь в руках исследователей имеются эффек­тивные и воспроизводимые методы трансформации бакте­рий молекулами плазмидной ДНК и упаковки ДНК бак­териофага Я in vitro в инфекционные вирусные частицы.

ТРАНСФОРМАЦИЯ Е. coli ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

В основе большинства методов бактериальной трансформа­ции лежит наблюдение (Mandel, Higa, 1970), согласно кото­рому обработка бактерий хлористым кальцием увенчивает эффективность поглощения ИШГД И Кб а ктерио фаг а X. В 1973 г. было установлено, что подобным же образом дело обстоит и с плазмидной ДНК (Cohen et al., 1973). С тех пор предложе­ны различные варианты основного метода, разработанные с целью увеличения эффективности трансформации у разных штаммов бактерий. Выход трансформантов в брльшинстве слу­чаев составляет Ю⁵—10⁷- на- 1 мкг pBR322.

В последнее время найдены условия (Hanahan, неопубликован­ные данные; см. с. 242), в которых штамм Е. coli %1776 вос­производимо дает 10⁷—10⁸ трансформантов на 1 мкг интакт- ной ДНК pBR32S7 Как ни впечатляюща такая эффективность, но все же следует отдавать себе отчет, во-первых, в том, что компетентна (т. е. способна поглощать плазмидную ДНК) Только очень небольшая фракция клеток* и, во-вторых, в том, что в трансформации успешно участвует дишь 1 из приблизи­тельно 10 ООО молекул ДНК • -

После проьШШавеШГй в' бактерию происходит репликация плазмидной ДНК и начинается экспрессия маркеров устойчи­вости к лекарственным препаратам, в результате чего транс­форманты приобретают устойчивость к антибиотику.

Бактерия способна пог^н^ать ДНК^в^_течение__ короткого периода времени, шПГ р езу л ьт а те выдерживания с агентами, повышающими эффективность трансформации, большинство

бактериальных штаммов приобретает способность сохранять состояние компетентности на протяжении 1—2 дней. Компетент­ные клетки штамма % 1776 можно приготовить в больших коли­

чествах, проверить и хранить замороженными. Правда, клетки этого штамма прихотливы и требуют дорогостоящей ростовой среды. По этой причине их чаще всего используют только для начальной трансформации и скрининга, а затем переходят на плазмидную ДНК, получаемую в небольших количествах (с. 332), и ею трансформируют клетки более обычных штаммов^

ТРАНСФОРМАЦИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХЛОРИСТОГО КАЛЬЦИЯ

Этот способ трансформации бактерий плазмидной ДНК при­меняется наиболее часто (Mandel, Hida, 1970). Выход транс­формантов составляет 10⁵— 10⁷ на 1 мкг интактной ДНК рВР322 при использовании штамма Е. colx НВ101.

1. Внесите в 500-мл колбу 100 мл бульона L и 1 мл ночной

культуры бактерий. Выращивайте клетки при 37 °С с интен­сивным перемешиванием до плотности — 5 * 10⁷ клетка/мл. Обычно это занимает 2—4 ч. Для одной пробы на трансформа­цию требуется 3 мл клеток. *

Примечание. Соотношение между оптической плотностью и числом жианеспособных бактерий в 1 мл культуры варьирует от штамма >к штамму. Например, для штаммов гес+(% 1776, ММ284) концентрации 5-10⁷ клетка/мл соответствует D550 = = 0,2, а для штаммов rec~~ (DH1, НВ101) концентрации 5* 10⁷ клетка/мл соответствует D₅5o = 0,5. Калибровочную кривую за­висимости D550 от числа бактерий в 1 мл культуры следует строить для каждого нового штамма Е. coli, применяемого в работе.

2. Охладите культуру во льду (10 мин). Отцентрифугируй­те суспензию клеток при 4000 g в течение 5 мин при 4°С.

3. Удалите надосадочную жидкость. Р£0^пендщ>уйт^

jgtr в половине начального объема охлажденного во льду сте­рильного раствора 50 MMs^aCl^+lO мМ трис-НС], pH 8,0.

4. Поместите суспензию клеток ЕПЩцЯную баню^аДД^шш, а затем отцентрифугируйте суспензию п‘риТ00бГ^~'в течение

5. мин приТРЧ!! ^

5. Удалите надосадочную жидкость, ^есуспевдируйте аслят- ки в 1/15 начального объема охлажденного во льду стериль­ного раствора 50 мМ CaCil₂+10 мМ трис-HCl, pH 8,0. Распре* делите аликвоты объемом'мл по предварительно охлаж­денным пробиркам. Клетки можно хранить при 4°С 12—24 ч.

Примечание. Для максимальной эффективности трансфор­мации очень важно, 1) чтобы бактерии находились в ^лога­рифмической фазе роста и чтобы во время обработки хлорис­тым кальцием щютность^суспензии была низкой: 2) чтобы клет­ки выдерживались при 4°С 12—24 ч. За это время эффектив-

носуь трансформации возрастает в 4—6 раз (Dagert, Ehrlich, 1970). Через 48 ч она снизится до первоначального уровня.

6. Добавьте ДНК в буфере, применяемом для реакции с ли-

газами (лигазный буфер), или в буфере ТЕ. Размешайте и ин­кубируйте смесь во льду 30 мин. Для каждой пробы можно

брать до 40 нг ДНК (соответственно 100 мкл лигазного буфе­ра или буфера ТЕ). Увеличение количества ДНК или объема буфера приводит к снижению эффективности трансформации.

7. Перенесите пробы в водяную баню (42 °С) на 2 мин.

8. Добавьте в каждую пробирку по 1,0 L и ин­

кубируйте 30 мин при .37 °С (при jpgxpадиклтоовай..хелекции>. или 1ч (при ампициллиновой или канамициновой селекции) без качания. За это время в бактериях пройдет процесс вос­становления и начнется экспрессия генов устойчивости к анти­биотикам.

9. Высейте удобное количество клеток на плотную селектив­ную среду, используя методику растирания (распределения! клеток шпателем) или методику верхнего агара (с. 77). В пос­леднем случае трансформантов получается несколько больше.

Если селекцию ведут на устойчивость к тетрациклину, то трансформационную смесь можно целиком высеять в одну чашку. При селекции на устойчивость к ампициллину в чашку следует высевать только часть культуры, (найденную эмпири­чески), так как число вырастающих трансформантов увеличив вается не пропорционально высеваемому объему, возможно, из- за накопления в среде токсичных веществ, выделяемых убитые ми антибиотиком клетками. Кроме того, при селекции на ус­тойчивость к ампициллину _плрхпосхь. высеваемой суспензия должна быть низкой, а чашки нужно перенести через 16—24 ч^. из термостата в холодильник (4°С). Дело в том, что ампицил­лин разрушается р-лактамазой, секретируемой устойчивыми трансформантами, поэтому при густом засеве или длительной- инкубации вокруг колоний трансформантов вырастут сателлит- ные колонии, сформированные чувствительными антибиотиг- ку клетками.

10. Оставьте чашки при комнатной температуре, пока не' затвердеет верхний агар или не впитается жидкость.

11. Переверните чашки и инкубируйте их при 37 °С. Коло­нии должны появиться через 12—16 ч.

ТРАНСФОРМАЦИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ХЛОРИСТОГО КАЛЬЦИЯ И ХЛОРИСТОГО РУБИДИЯ

Этот метод (Kushner, 1978) больше всего подходит для штамма Е. coli SK1590 (приложение В). Эффективность транс­формации других штаммов Е. coli также выше, чем та, кото­рая достигается при использовании предыдущего метода.

16—164

1. В 500-мл колбу внесите 100 мл бульона и 0,5 мл ночкой .культуры бактерий. Наращивайте клетки при 37 °С с интенсив­ным перемешиванием до плотности ~5*10⁷ клетка/мл (см. примечание к стадии 1, с. 240). Для каждой пробы требуется

2. мл клеток.

2. Отцентрифугируйте аликвоты по 2 мл культуры (Ь10⁸ жлеток) (в стерильных 15-мл корексовых пробирках при 4000 g в течение 10 мин при 4°С.

3. Удалите надосадочную жидкость. Осторожно ресуспен- „дируйте осадок в 1 мл стерильного раствора, содержащего .10 мМ MOPS (морфолинопропансульфоновой кислоты), pH 7,0, и 10 мМ RbCl.

4. Осадите клетки центрифугированием при 4000 g в тече­ние 10 мин при 4°С.

5. Удалите надосадочную жидкость. Осторожно ресуспенди­руйте клетки в 1 мл раствора, содержащего 0,1 М MOPS, pH «6,5, 50 мМ СаСЬ и 30 мМ RbCI.

6. Поместите бактерии в лед на 15 мин.

7. Соберите клетки центрифугированием при 4000 g в тече­ние 10 мин при 4°С.

8. Удалите надосадочную жидкость как можно более полно. Осторожно ресуспендируйте осадок в 0,2 мл стерильного раст­вора, содержащего 0,1 М MOPS, pH 6,5, 50 мМ СаС1₂ и ЮмМ RbCl.

9. Добавьте 3 мкл диметилсульфоксида (Spectroquality DMSO; Matheson, Coleman and Bell) и 1—200 нг ДНК в 10 мкл

(или меньше) буфера ТЕ, pH 8,0.

Примечание. Продукты окисления DMSO сильно подавляют трансформацию. Поэтому свежий раствор спектрально чистого DMSO хранят в замороженном виде при —70 °С в аликвотах зло 0,5 мл. Аликвоты используют только один раз, а оставшуюся часть выбрасывают.

10. Поместите пробы в лед на 30 мин.

11. Перенесите их в водяную баню с температурой 43—

44. °С на 30 с.

12. Добавьте бульон L до объема 5 мл. Инкубируйте 60 мик при 37 °С без качания.

13. Сделайте посев на селективную среду, как описано на *с. 77. При необходимости перед посевом клетки можно скон­центрировать центрифугированием.

ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК Е. coli /1776

Описанный ниже метод является наиболее эффективным из всех имеющихся (Hanahan, неопубликованные данные). Его ?пропись можно во всех деталях использовать только для 1Е. coli х1776. С некоторыми небольшими изменениями (см. при-

мачание на с. 244) он пригоден и для ряда других штаммов» Е соМ (ММ294), С600, DH1, но не для НВ101). Правда, в по­следнем случае эффективность трансформации несколько 'ни­же.

1. Разведите 1 мл ночной культуры штамма %1776 Е. colt 100 мл бульона для выращивания %1776 в 500-мл колбе. Инкуби­руйте при 37 °С с интенсивной аэрацией до плотности 5-10^г клетка/мл (Dsso = 0,2; см. примечание к п. 1, с. 240). Обычна* для этого требуется 3—4 ч роста. Для одной трансформацион­ной пробы 'необходимо 5 мл культуры.

Примечание. Штамм %1776 очень чувствителен к детерген­там, поэтому можно использовать только очень тщательно вы­мытую стеклянную или пластмассовую посуду. Не забудьте: также, что для роста ^1776 нужны диаминопимелиновая кис­лота и тимидин (с. 390).

2. Отцентрифугируйте клетки при 4000 g в течение 5 мин> при 4°С.

3. Удалите надосадочную жидкость. Осторожно ресуспенди­руйте клетки в 0,2 объема ледяного буфера, используемого при; трансформации %1776. Поместите суспензию в лед на 5 мин.

Буфер, используемый при трансформации %1776, pH 5,8, имеет состав: 100 мМ JRbCl, 45 мМ МпСЬ, 10 мМ СаС1₂, 5 mAV MgCl₂, 0,5 мМ LiCl, 35 мМ ацетат калия, pH 6,2 и 15%-ная сахароза (Shwartz-Mann).

Приготовление буфера. Сделайте раствор, содержащий все компоненты, за исключением RbCl и MgCb. Добавьте твердые* RbCl и MgCl₂ и осторожно доведите pH раствора до 5,8 разве­денной уксусной кислотой. Простерилизуйте раствор фильтро­ванием и заморозьте аликвоты при —20 °С.

4. Отцентрифугируйте клетки при 4000 g в течение 5 мин. при 4°С.

5. Удалите надосадочную жидкость. Осторожно ресуспен­дируйте клетки в 0,04 объема исходной культуры охлажденно­го льдом буфера, используемого при трансформации. Внесите- по 0,2 мл суспензии в предварительно охлажденные пробирки! и оставьте их во льду на 5 мин.

6. В каждую пробирку добавьте 6 мкл DMSO (Spectroquali- ty DMSO; Matheson, Coleman and Bell; см. примечание к п. 9_r с. 242). Поместите пробы в лед на 15 мин.

Примечание. Компетентные -клетки можно приготовите впрок и хранить отри —70 °С следующим образом. Приготовьте- клетки, как описано в п. 1—6, а затем разлейте порциями по» 200 мкл в стерильные эппендорфовские пробирки. Как можно быстрее заморозьте каждую аликвоту в сухом льду с этанолом и храните при —70 °С. По мере надобности размораживайте каждую аликвоту, помещая ее на 30 мин в лед, и продолжайте трансформацию с п. 9. При хранении *клеток три —70 °С он®

16-

остаются компетентными для 'трансформации по крайней ме­ре в течение 6 мес (это не относится к штаммам DH1, С600или ММ294).

7. Быстро ааморозьтв клетки, поместив пробирку на 20 с в смесь сухой лед—этанол (—55 °С).

8. Быстро разморозьте клетки, поместив пробирку в воду .комнатной температуры. Когда клетки оттают, перенесите про­бирку в ледяную баню на 5 мин.

9. Добавьте 7 мкл DMSO, перемешайте и поместите про­бирку в лед ,на 5—10 мин.

10. Добавьте 1—25 нг ДНК в 1 —10 мкл буфера для лиги­рования или буфера ТЕ, pH 7,4. Поместите пробу в ледяную ^баню на 10—30 мин.

11. Быстро заморозьте клетки, опустив пробирку на 30—60 с ж баню с сухим льдом и этанолом.

12. Быстро разморозьте клетки, поместив пробирку в воду комнатной температуры. Сразу после оттаивания перенесите лробирку в ледяную баню.

13. Быстро нагрейте клетки, опустив пробирку на 1 мин в водяную баню с температурой 42 °С или на 2 мин в баню с температурой 37 °С.

14. Добавьте 1 мл бульона для выращивания %\71§ и ин­кубируйте 30 мин (при тетрациклиновой селекции) или 1 ч (при ампициллиновой или канамициновой селекции) при 37°С без перемешивания.

15. Сделайте посев клеток на селективную среду, как опи­сано на с. 77.

Примечания.

А. Данный метод можно использовать и для других штам­мов Е. coli (например, DH1, С600, ММ294), если не добавлять в буфер для трансформации MgCb и LiCl и опустить стадии 7 и 11 (быстрое замораживание). Эффективность трансформа­ции в этих условиях составляла 10⁷—10⁸ трансформантов на

1. мкг сверхспиральной ДНК pBR322.

Б. По неизвестной причине этот метод не дает хороших ре­зультатов с Е. coli НВ101.

УПАКОВКА ДНК БАКТЕРИОФАГА / IN VITRO

Упаковка ДНК бактериофага К вначале проводилась с ис­пользованием смесей экстрактов из бактерий, зараженных му­тантами бактериофага X по генам, контролирующим сборку фаговых частиц (Becker, Gold, 1975). Позднее метод был улуч­шен и модифицирован в ряде лабораторий, и теперь эффек­тивность упаковки воспроизводимо достигает 10⁷—10⁸ фаго- авых частиц на 1 мкг интактной ДНК X. В инфекционные ви­русные частицы упаковывается приблизительно 0,05—0,5% мо­лекул ДНК К присутствующих в реакционной смеси.

Этапы упаковки ДНК бактериофага к и влияние различ­ных мутаций на сборку фаговых частиц схематично представ­лены на рис. 1.8.

Белок Е является главным компонентом головки бактерио­фага; он необходим для сборки самого раннего из .идентифи­цированных предшественников. Мутанты, лишенные белка Е, накапливают все компоненты вирусной капсиды.

Белок D размещается на наружной стороне головки и уча­ствует в сопряженных процессах внедрения ДНК к в предше­ственника головки и последующего созревания головки. Мутан­ты по гену D накапливают незрелые предголовки, но не могут осуществить этап внедрения ДНК к в головку.

Белок А необходим для внедрения ДНК к в головку бак­териофага и расщепления конкатенанов — предшественников ДНК — на участках липких концов (cos). Мутанты по гену А также накапливают пустые предголовки. Из клеток, инфициро­ванных мутантами А~ и Е“ или D“ и Е^_, получают дополняю­щие друг друга (комплементирующие) экстракты; кроме того, экстракт, приготовленный из клеток, зараженных мутантом А“, можно дополнить очищенным белком А дикого типа.

Экстракты обычно готовят из клеток, лизогенных по бак­териофагу к соответствующего генотипа (амбер-мутации в ге­нах A, D или £). Лизогены несут также следующие мутации.

1. Мутацию cl/s857, отвечающую за температурочувсави- тельность молекулы репрессора фага к. У этого мутанта ДНК фага к поддерживается в лизогенном состоянии, если (бакте­рии хозяина растут при 32 °С; рост бактериофага индуцирует­ся при повышении температуры до 42—45 °С, при которой инак­тивируется репрессор, кодируемый геном сI.

2. Амбер-мутацию Sam7 в гене S бактериофага, контроли­рующем лизис клетки. Эта мутация обусловливает накопление компонентов капсиды в клетках бактерий Sulll~ через 2—3 ч после индукции лизогена els/857.

3. Делецию в области b (62 или М007) генома бактерио­фага, захватывающую участок присоединения (att) ДНК к к бактериальному геному. Эта мутация частично снижает эф­фективность упаковки эндогенных молекул ДНК к в экстрак­тах, приготовленных из индуцированных клеток.

4. Мутации red3 (у фага к) и гесА (у Е. coli), инактивиру­ющие генерализованные рекомбинационные системы бактерио­фага к и хозяина и благодаря этому сводящие к минимуму ре­комбинацию между эндогенной ДНК фага к> содержащейся в экстракте, и экзогенно добавляемыми рекомбинантными ге­номами.

Лизогенные бактерии, предназначенные для получения экст­рактов для упаковки, обычно выращивают при 30—32 °С до середины экспоненциальной фазы, индуцируют литические

функции, инактивируя репрессорный белок с\ повышением тем­пературы до 45 °С, «и подращивают культуры 2—3 ч при 38— 39 °С, что приводит к накоплению компонентов, необходимых для упаковки. Затем готовят клеточные экстракты.

Две прописи, представленные ниже, являются наиболее про­стыми из тех, что опубликованы. Обе они дают возможность получить высокоэффективные экстракты для упаковки. Пре­имущество прописи I состоит в том, что упаковываются реком­бинантные молекулы разных размеров. Ее главный недоста­ток— относительно высокий уровень фоновых бляшек, наблю­дающийся в некоторых опытах, который обусловлен упаков­кой эндогенной ДНК фага X. Достоинствами прописи II явля­ются простота, высокая эффективность, низкий фон и селекция молекул рекомбинантной ДНК по размеру.

Существуют также две другие, несколько более усложнен­ные методики приготовления упаковочных экстрактов. Одна из них (Sternberg et al., 1977) является эффективной, но предпо­лагает получение двух разных экстрактов и довольно сложную процедуру упаковки. В другой (Faber et al., 1978) необходимо очищать белок А бактериофага К и готовить два разных экст­ракта.

ПОДДЕРЖАНИЕ И ПРОВЕРКА ЛИЗОГЕННЫХ КУЛЬТУР

Успешное приготовление упаковочных экстрактов зависит от наличия специфических мутаций в геноме бактериофага К₉ поэтому особые усилия должны быть направлены на выращи­вание и поддержание лизогенов бактериофага X. Мы рекомен­дуем соблюдать следующие предосторожности.

1. Основные штоки ¹ Е. coli ВНВ2690 и ВНВ2688 следует хранить в, глицерине при —70 °С, как описано в гл. 1. Экстрак­ты нужно готовить из материала, отсеянного прямо из этих штоков в соответствии с приведенной ниже методикой.

2. Необходимо убедиться в наличии мутации, сообщающей температурочувствительность продукту гена сI. Для этого сде­лайте посев штрихом со штоков Е. coli ВНВ2690 и ВНВ2688 в чашки с L-бульоном (2 чашки для каждого штамма). Инку­бируйте одну чашку каждого штамма при 30—32 °С, а другую при 42°С. Бактерии должны расти только в чашках, инкубиру­емых при 32 °С. Приготовьте ночную культуру (выращивание при 32 °С) каждого штамма из материала, взятого из отдель­ной колонии, и еще раз проверьте их, высеяв аликвоты в чаш­ки, инкубируемые при 32 и 42 °С, как описано ниже. Если бак-

¹ Штоком называют запасную культуру данного штамма, хранящуюся в соответствующих условиях. — Прим. ред.

термостате при 32 °С; на следующий день они должны выгля­деть так, как показано на рис. 8.1 {внизу).

Мутация гесА блокирует репарацию УФ-индуцированных повреждений, так что облученные 'клетки гесА~ не растут. Раз* ные мутанты гесА~ гибнут при разных дозах УФ-излучения (ср. штаммы Е. coli НВ101 и 1046).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ УПАКОВОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ; МЕТОДИКА I

По этой методике лизогены Е. coli ВНВ2690 (Z)am) и: ВНВ2688 (fam) выращивают отдельно, индуцируют, смеши­вают, концентрируют и замораживают по порциям. ДНК, ко­торая должна 'быть упакована, добавляют прямо в пробирку, со­держащую упаковочный экстракт (Hohn, 1979).

1. Приготовьте субкультуры из основных штоков Е. coli ВНВ2690 и ВНВ2688 и проверьте их генотипы, как описано на с. 246.

2* Определите D₆oo ночной культуры каждого штамма (50 мл). Для получения свежей культуры каждого штамма внесите в 2-л колбы по 500 мл среды М9, подогретой до32°С, и клеточную суспензию до начальной оптической плотности Deoo—0,1.

3. Растите клетки при 32 °С с интенсивным перемешивани­ем до тех пор, пока D6oo каждой из культур не увеличится до

0. 3 (2—3 ч роста, если начальная Обоо^ОД). Важно, чтобы во время индукции клетки находились в середине логарифмичес­кой фазы роста.

3. Индуцируйте лизоген, поместив колбы в водяную баню на 45 °С. Непрерывно перемешивайте культуры в течение 15 мин. По другой методике культуру индуцируют, помещая колбы в водяную баню с качалкой на 65 °С. Как только тем­пература культуры достигает 45 °С, колбы переносят в водя­ную баню на 45 °С и оставляют на 15 мин.

4. Инкубируйте индуцированные клетки 2—3 ч при 38—

39 °С с интенсивной аэрацией. Проверьте, произошла ли индук­ция, добавляя каплю хлороформа к небольшому объему куль­туры; последняя должна просветлеть через несколько минут (с. 90—91). _в

3. Смешайте две культуры, охладите их в бане с ледяной водой и соберите бактерии центрифугированием при 4°С в те­чение 10 мин при 4000 g.

4. Отбросьте надосадочную жидкость. Промойте клетки в 300 мл холодной среды М9, не содержащей казаминокислот. Соберите бактерии центрифугированием, как описано выше.

5. Отбросьте надосадочную жидкость. Все остальные этапы следует проводить в холодной комнате. -Переверните центри­фужную пробирку и дайте жидкости стечь с осадка. Удалите

капли среды пастеровской пипеткой. Протрите стенки центри­фужной пробирки бумажной салфеткой.

3. С помощью силиконированной пастеровской пипетки ре- суспендируйте клетки в 0,004 исходного объема (т. е. клетки из 1 л культуры © 4 мл) свежеприготовленного буфера СН. Он отличается от буфера, используемого при упаковке космид (с. 281), тем, что содержит путресцин и, следовательно, способ­ствует упаковке молекул ДНК больших размеров (Hohn, 1979).

Буфер СН имеет состав: 40 мМ трис^НС1, pH 8,0, 1 мМ спермидин, 1 мМ путресцин, 0,1%-ный p-меркаптоэтанол и 7%-ный DMSO (Spectropure; Matheson, Coleman and Bell).

3. Перенесите суспензию бактерий в маленькую стеклян­ную пробирку. Если суспензия гомогенная, для внесения алик­вот по 50 мкл в предварительно охлажденные 1,5-мл эппендор- фовские пробирки можно использовать автоматическую пи­петку. Кончик пипетки нужно срезать, чтобы увеличить диа­метр отверстия, иначе не удастся набрать вязкую суспензию. Работайте быстро и периодически встряхивайте бактериальную суспензию.

4. После переноса каждой аликвоты закройте пробирку и опустите ее в жидкий азот.

5. Выньте пинцетом пробирки из жидкого азота и немед­ленно поместите аликвоты в кельвинатор на —70 °С.

Экстракты, приготовленные и хранящиеся подобным обра­зом, стабильны по крайней мере в течение 6 мес.

УПАКОВКА IN VITRO; МЕТОДИКА I

1. Смешайте 0,1—1,0 мкг ДНК, растворенной в 5 мклббмМ трис-НС1, pH 7,9, +10 мМ MgCl₂, соответствующий объем бу­фера СН [см. примечание а) ниже] и 1 мкл 0,1 М АТР, pH 7,5. Смесь оставьте ©о льду.

Примечание, а) Каждую партию экстрактов необходимо титровать, чтобы определить оптимальный объем для упаковки. При титровании к стандартной смеси для упаковки, содержа­щей 0,5 мкг интактной ДНК бактериофага К и 50 мкл экстрак­та, добавляют разные количества 'буфера СН (0—50 мкл), со­держащего 1,5 мМ АТР. Изменяя оптимальное разведение, можно иногда увеличить эффективность упаковки на порядок и больше. Для титрования разных партий экстрактов исполь­зуйте один и тот же препарат ДНК фага К, который должен храниться в аликвотах при — 20 °С.

б) 0,1 М АТР приготовьте следующим образом: раствори­те 60 мг АТР >в 0,8 мл Н2О. Доведите pH до 7,0 с помощью

0. 1 М NaOH. Доведите объем водой до 1,0 мл. Храните раст­вор в малых аликвотах при —70 °С.

2. Достаньте из кельвинатора три пробирки с упаковочны­ми экстрактами и поместите их в лед. Лучше не ставить более

трех реакций упаковки одновременно. Пока экстракты еще заморожены, добавьте к ним смесь, приготовленную на стадии

1. Когда экстракты оттаят, хорошо размешайте содержимое- пробирок запаянной капиллярной пипеткой.

Примечание. ДНК необходимо смешивать с экстрактами,, как только они оттаят, потому что сборка компонентов фага начинается сразу после лизиса клеток, который происходит во* время оттаивания. Этот этап является критическим. Если эк­стракт оттает прежде, чем завершится размешивание, высво­бождающаяся бактериальная ДНК увеличит вязкость содер^ жимого пробирки, и эффективное размешивание добавленной фаговой ДНК станет невозможным.

3. Инкубируйте смеси 60 мин при 37 °С.

4. Достаньте из кельвинатора еще несколько пробирок с экстрактами для упаковки. Поместите их в лед. Добавьте в* каждую пробирку по 5 мкл панкреатической ДНКазы (100 мкг/ /мл) и 2,5 мкл 0,5 М MgCl₂. Когда экстракты оттаят, переме­шайте содержимое пробирок и поставьте их в лед на 5—10 мин. В каждую пробу добавьте по 20 мкл второго упаковочного эк­стракта (содержащего панкреатическую ДНКазу и MgCl₂). Хорошо перемешайте и инкубируйте еще 30 мин при 37 °С. Во время инкубации встряхивайте пробирку щелчком каждые не­сколько минут.

Примечания, а) Добавление второй порции экстракта уве­личивает эффективность упаковки в 2—5 раз, вероятно, бла­годаря внесению дополнительных фаговых компонентов, не­обходимых для некоторых этапов морфогенеза после сборки головки.

б) Добавление ДНКазы приводит к быстрому снижению вязкости раствора. Если вязкость заметно не снижается, до­бавьте еще одну порцию панкреатической ДНКазы и инкуби­руйте еще 5 мин.

5. Добавьте в каждую пробу 1 мл буфера SM и 5 мкл хло­роформа. Перемешайте и удалите клеточные обломки центри­фугированием в центрифуге Эппендорф в течение 30 с. Протит- руйте число жизнеспособных частиц бактериофага в надоса- дочной жидкости, как описано на с. 80. Фаговые частицы ос­таются стабильными в течение нескольких недель в смеси для упаковки, содержащей буфер SM и хлороформ.

Примечание. В связи с тем что компоненты экстрактов для упаковки могут ингибировать процесс инфекции бактерий фа­говыми частицами, объем смеси для упаковки, высеваемой в чашку, ограничен. Степень ингибирования определяют эмпи­рически для каждой партии экстрактов. Для этого смесь для упаковки, в которой отсутствует ДНК, смешивают с известным числом инфекционных частиц, добавляют увеличивающиеся объемы упаковочных экстрактов и 1 мл буфера SM и после

10-мин инкубации при комнатной температуре делают посевы для определения титра бактериофага. Обычно ингибирование оказывается заметным только в тех случаях, когда в одну чашку диаметром 85 мм высевают более 1/10 объема пробы.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ ДЛЯ УПАКОВКИ; МЕТОДИКА II¹

Обработка ультразвуком экстракта из индуцированных клеток ВНВ2690 (донор предголовки)

1. Получите субкультуру из основного штока £. coli ВНВ2690. Проверьте генотип клеток, как описано на с. 246.

2. Измерьте Ббоо 100-мл ночной культуры и внесите в 2-л колбу с 500 мл бульона NZM, (Подогретого до 32 °С, столько клеток, чтобы D₆oo была ^0,1. Инкубируйте с аэрацией при 32°С до Deoo = 0,3 (2—3 ч инкубации). Важно, чтобы во вре­мя индукции культура находилась в середине экспоненциаль­ной фазы роста.

3. Индуцируйте лизогены, поместив колбы в водяную баню с температурой 45 °С. Непрерывно перемешивайте культуры в течение 15 мин.

Можно также индуцировать культуру, поместив колбу в ка­чалку с водяной баней на 65°С. Как только температура внут­ри колбы поднимется до 45 °С, перенесите культуру на 15 мин в водяную баню с температурой 45 °С.

4. Инкубируйте индуцированные клетки при 38—39 °С 2— 3 ч с интенсивной аэрацией. Убедитесь в эффективности ин­дукции добавлением капли хлороформа к небольшой пробе, взятой из культуры; проба должна просветлеть в течение 'не­скольких минут.