многими РНКазами и практически полностью подавляющими их активность (Berger, Birkenmeier, 1979). Четыре ©анадилри- бонуклеозидных комплекса добавляют к инта^тным клеткам и (используют их в (концентрации 10 мМ на всех стадиях выде­ления и очистки РНК. Это обеспечивает высокий выход РНК, получаемой в форме, которую можно эффективно транслиро­вать в беоклеточной системе синтеза белка. При необходимости ванадилрибонуклеозидные комплексы могут 'быть удалены из препарата РНК с помощью многократной экстракции фенолом, содержащим 0,1% 8-гидроксихи1нолина.

Ванадилрибонуклеозидные .комплексы получают следующим образом (Berger, Birkenmeier, 1979).

1. Растворите 0,5 ммоль одного из четырех рибонуклеози- дов в 8 мл воды в кипящей водяной бане.

2. Пропуская через раствор газообразный азот, добавьте 1 мл 2 М сульфата ванадия.

3. Доведите pH до ~6,0, добавляя по каплям 10 М NaOH.

4. Доведите pH точно до 7,0, добавляя по каплям 1 М NaOH в атмосфере газообразного азота в водяной бане. По мере образования комплексов раствор меняет окраску с синей на темно-зеленую.

5. Доведите объем до 10 мл; разделите раствор на неболь­шие аликвоты и храните при —20 °С в атмосфере газообразно­го азота. Концентрация образовавшегося комплекса 200 мМ. Перед использованием разбавьте раствор в соотношении 1 : 20.

Имеющиеся в продаже препараты ванадилрибонуклеозид- ных (комплексов производят исследовательские лаборатории Бе- тезды (Bethesda Research Laboratories, P. О. Box 577, Gaither­sburg, M. D. 20760).

РНКазин. РНКазин — белок (мол. масса ~40 000), сильный ингибитор РНКазы, выделенный из печени крысы и плаценты человека. РНКазин эффективно ингибирует РНКазу при транс­ляции в бесклеточной системе (Scheel, Blackburn, 1979) и об­ратной транскрипции мРНК (de Martynoff et al., 1980). Так же как и ванадилрибонуклеозидные комплексы, РНКазин можно использовать в ферментативных реакциях. Его преимущество перед ванадилрибонуклеозидными комплексами состоит в том, что он легко экстрагируется фенолом.

Имеющиеся в продаже препараты РНКазина производит фир­ма Biotec (Biotec Inc., 2800 Fish Hatchery Rd., Madison, W1 53711).

2. Методы разрушения клеток с одновременной инактивацией нуклеаз

Белки легко растворяются в растворах сильных хаотропных агентов, таких, как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат (Сох, 1968). При разрушении клеточных структур после утраты

регулярных вторичных структур происходит быстрое отделение нуклеопротеинов от нуклеиновых кислот. Даже РНКаза — фер­мент, устойчивый ко многим видам сильных физических воздей­ствий (таких, как кипячение),—-неактивна в присутствии 4 М гуанидинизотиоцианата и восстановителей, подобных (З-меркап- тоэтанолу (Sela et al., 1957). Поэтому комбинация этих соеди­нений может быть использована для выделения недеградирован­ной РНК из богатых РНКазой тканей, например поджелудочной железы (Chirgwin et al., 1979).

Гуанидинизотиоцианат получают следующим образом.

1. В банку с гуанидинизотиоцианатом (100 г; фирма East­

man Laboratory and Special Chemicals или Fluka) добавьте 100 мл деионизованной Н₂0, 10,6 мл 1 М трис-HCl, pH 7,6, и

6. мл 2 М ЭДТА. Перемешивайте в течение ночи при комнат­ной температуре. '

2. Для улучшения растворения прогревайте раствор при непрерывном перемешивании при 60—70 °С в течение 10 мин. При этом часто остается осадок нерастворившегося материала, который удалите центрифугированием при 3 000 g в течение 10 мин при 20 °С.

3. К надосадочной жидкости добавьте 21,2 мл 20%-ного саркозила (лаурилсаркозината натрия) и 2,1 мл (3-меркапто- этанола и доведите объем до 212 мл, используя стерильную

Н₂0.

4. Профильтруйте через фильтр Nalgene и храните при 4°С в плотно закрытой склянке из коричневого стекла.

3. Использование свободной

от РНКазы стеклянной и пластмассовой посуды

Имеющаяся в лабораториях стерильная пластмассовая по­суда полностью лишена РНКазы и может быть использована для выделения и хранения РНК без предварительной обработ­ки. Однако обычная лабораторная стеклянная посуда часто оказывается источником загрязнения РНКазой, и ее следует прокалить при 250 °С в течение 4 ч или более. Помимо этого, некоторые исследователи обрабатывают стеклянную посуду в течение 12 ч при 37°С раствором 0,1%-иого диэтилпирокарбо- ната —аильного, но не абсолютного ингибитора РНКазы {Fedorcsak, Ehrenberg, 1966). Перед использованием посуды, обработанной таким способом, важно удалить следы диэтил- мрокарбоната с помощью нагревания до 100 °С в течение 15 мин (Kumar, Lindberg, 1972) или автоклавирования. В про­тивном случае существует опасность, что остаточный диэтил- пирокарбонат инактивирует РНК в результате карбоксимети- лирования.

Весьма разумно отделить стеклянную и пластмассовую по­суду, которая будет использована только для экспериментов с