Глава 6

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И АНАЛИЗ мРНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Типичная клетка млекопитающего содержит ~10^-5 мкг РНК» 80—85% которой составляет р и босо ми а я РНК (в основном 28S, 18S «и 5S), а 10—15% приходится на долю различных низкомолекулярных РНК (транспортные, низ­комолекулярные ядер'ные и т. д.). РНК каждого из этих типов характеризуется определенным размером молекул и последовательностью оснований и может быть выделе­на практически в чистом виде с помощью гель-электро­фореза, центрифугирования в градиенте плотности или ионообменной хроматографии. В отличие от этого мРНК» составляющая от 1 до 5% всей РНК клетки, гегерогенна как по размеру (от 200 до 'нескольких тысяч оснований), так и по последовательности оснований. Однако практи­чески все мРНК млекопитающих имеют 'на З'-конце poly (А)-фрагмент, длина которого достаточна для очистки мРНК с помощью аффинной хроматографии на oligo- (dT)-целлюлозе; получаемая при этом физически гетеро­генная популяция молекул в совокупности кодирует все полипептиды, синтезируемые 'клеткой.

Ключевые Моменты при получении хороших препара­тов эукариотических мРНК — это сведение к минимуму рибонуклеазной активности на начальных стадиях выде­ления и исключение возможности случайного внесения следовых (количеств рибонуклеазы со стеклянной посуды и из растворов. В последующих четырех разделах мы ак­центируем на этом особое внимание. Содержание этих разделов имеет существенное значение для успешного вы­деления мРНК из клеток млекопитающих.

1. Использование экзогенных ингибиторов рнКаз

В настоящее время наибольшее распространение получили два типа ингибиторов РНКазы: ванадилрибонуклеозидные

комплексы и РНКазин.

Ванадилрибонуклеозидные комплексы. Комплексы, образо­ванные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеози- дов, являются аналогами РНК, временно связывающимися со