•СИ,

■СНз

н соо®

^R

аминокислоты

для других природных соединений

А. Биологические функции аминокислот

сосг

соо^с

H₃N-[c]-H

L-аминокислота (реальное изображение)

Б. Стереохимия аминокислот

Чэоэ

н-[э]-

©

И_ЕН

фишеровские проекции

D-аминокислота (зеркальное изображение)

pH 7,6 изоэлектрическая точка

В. Кривая титрования гистидина

О +1 +2

суммарный заряд

Протеиногенные аминокислоты

А. Протеиногенные аминокислоты •

Протеиногенными называются 20 аминокис­лот, которые кодируются генетическим ко­дом (см. с. 244) и включаются в белки в про­цессе трансляции. Строение боковых цепей этих аминокислот приведено на с. 67.

Классификация этих аминокислот осно­вана как на строении, так и на полярности боковых цепей (см. с. 14).

В таблице для каждой из аминокислот приводятся следующие характеристики:

• классификация (семь классов);

• название и принятое сокращение (по трем первым буквам) (например, для гисти­дина — His);

• однобуквенный символ, удобный при записи белковых последовательностей (для гистидина — Н);

• полярность боковой цепи (для гистиди­на +10,3): чем выше эта величина, тем бопее полярна молекула аминокислоты.

На схеме по мере увеличения полярности окраска поля с названием аминокислоты ме­няется от желтых тонов через зеленые к си­ним. Для ионогенных групп боковой цепи приведены рКа (цифры красного цвета).

К алифатическим аминокислотам отно­сятся глицин, аланин, валин, лейцин и изо- лейцин. Эти аминокислоты не несут в боко­вой цепи гетероатомов (N, О или S), цикли­ческих группировок и характеризуются отчетливо выраженной низкой полярностью.

Также мапополярны серосодержещие аминокислоты — метионин и цистеин, при­чем цистеин существует лишь в недиссоции- рованном состоянии. Благодаря образова­нию дисупьфидных мостиков, цистеин выпол­няет важную функцию стабилизации про­странственной структуры белков. Аминокис­лота цистин состоит из двух остатков цистеи- на, соединенных дисульфидным мостиком.

Ароматические аминокислоты содержат мезомерные (резонансно стабилизирован­

ные) циклы (см. с. 12). В этой группе лишь фенилаланин проявляет низкую полярность. Тирозин и триптофан характеризуются за­метной, а гистидин — даже высокой поляр­ностью Имидазольное кольцо гистидина за­метно протонируется уже при слабокислых значениях pH. Поэтому гистидин, обладаю­щий ароматическими свойствами лишь в протонированной форме (см. с. 64), может быть отнесен к основным аминокислотам. Тирозин и триптофан сильно поглощают в УФ-области спектра между 250 и 300 нм.

Нейтральные аминокислоты содержат гидроксильные (серин, треонин) или карбо­ксамидные группы (аспарагин, глутамин). Хотя амидные группы неионогенны, молеку­лы аспарагина и глутамина высоко полярны

Карбоксильные группы боковых цепей кислых аминокислот — апарагиновой и глу­таминовой — полностью ионизированы во всем диапазоне физиологических значений pH. Аналогичным образом, боковые цели основных аминокислот — лизина и аргини­на — полностью протонированы в нейтраль­ной области pH. Сильно основной, а, следо­вательно, очень полярной аминокислотой, является аргинин, содержащий гуанидино­вую группировку.

Особое положение занимает пролин. Бо­ковая цепь пролина состоит из пятичленно­го цикла, включающего а-углеродный атом и а-аминогруппу. Поэтому пролин, строго говоря, является не амино-, а иминокисло- той Атом азота в кольце является слабым основанием и йе протонируется при физио­логических значениях pH. Благодаря цикли­ческой структуре пролин вызывает изгибы полипептидной цепи, что очень существен­но для структуры коллагена (см. сс. 76. 334).

Некоторые из перечисленных аминокис­лот не могут синтезироваться в организме человека и должны поступать вместе с пи­щей. Эти незаменимые аминокислоты (см. с. 348) отмечены звездочками красного цвета.

+9.7

+9,4

+11,0

+10.2

сн₂

I

HN^CH

' / НС—N

6.0

имидаэольное

кольцо

+10,3

+15,0

+20,0

А. Протеиногенные аминокислоты

Аминокислотный анализ

Разделение и анализ аминокислот и их про­изводных используются при определении аминокислотного состава белков, секвени- ровании пептидов а также с целью диагно­стики нарушений аминокислотного и белко­вого обмена, В этом разделе рассматрива­ются два наиболее важных в практическом отношении метода аминокислотного анали­за.

А. Ионообменная хроматография свободных аминокислот О

Ионообменная хроматография основана на электростатическом взаимодействии между ионами противоположного заряда. Главное условие при этом, чтобы ионы одного заря­да были ковалентно фиксированы на инерт­ном носителе Такой ионообменник будет связывать ионы противоположного заряда. При промывании ионообменника раствором с более высокой ионной силой или иным значением pH сорбированные ионы можно селективно перевести в раствор (элюиро­вать).

При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы синтетического полимера, несущие сульфо- группы (-SO3 ) Эти группы ионизированы во всем диапазоне pH и несут отрицатель­ный заряд Для подготовки к работе ионооб­менник помещают в колонку и промывают Ма⁺-содержащим буферным раствором с pH 2. При этом сульфогруппа (красный цвет) связывает ионы натрия (синий цвет). Если теперь нанести на колонку раствор амино­кислот (1а), то положительно заряженные аминокислоты (зеленый цвет) вытеснят ио­ны натрия и будут сорбированы на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их элюируют с ко­лонки буфером с более высоким значением pH (1 б) В качестве примера приведен экс­перимент (3) по разделению аспарагиновой кислоты, треонина и гистидина. Г рафики ти­трования (2) наглядно объясняют, почему три аминокислоты элюирутся в указанной последовательности.

Строго говоря, аминокислоты элюируют­ся при величинах pH, значительно ниже изо-

электрических точек, поскольку за связыва­ние с ионообменником конкурируют №⁺-ио- ны буферного раствора.

Б. Распределительная хроматография ФТЦ-производных аминокислот О

Распределительная хроматография основа­на на различной полярности разделяемых веществ. Если на инертный носитель нанес­ти малополярную неподвижную фазу, а за­тем смесь неполярных веществ, то они будут удерживаться носителем за счет гидрофоб­ного взаимодействия (см. с 34) Если такую колонку промыть смесью полярных раство­рителей (подвижной фазой) то компонен­ты смеси будут перемещаться с различной скоростью в зависимости от их полярности. Вначале будут элюироваться гидрофильные вещества, слабо взаимодействующие с не­подвижной фазой, а затем гидрофобные ве­щества.

В первых вариантах распределительной хроматографии гидрофильной была непод­вижная фаза, а гидрофобной — подвижная. Приведенная здесь современная модифика­ция метода носит название обращенно-фа- зовая хроматография (ОФХ).

Сначала при взаимодействии с фенил- изотиоцианатом получают производные аминокислот (1). ФТЦ-аминокислоты (FTC- аминокислоты) малополярны и благодаря поглощению в УФ-области спектра их можно обнаруживать в элюате фотометрически. В качестве неподвижной фазы используются мелкие частицы силикагеля (диаметром 5 мкм) с привитыми углеводородными цепями (лигандами). Использование мелкодисперс­ных носителей позволяет повысить качество разделения, однако при этом растет меха­ническое сопротивление колонки. Поэтому высокоэффективную жидкостную хро­матографию (ВЭЖХ) проводят в капилля­рах или колонках, выполненных из нержаве- юйщей стали, а злюент подают с помощью насосов высокого давления (2) В качестве элюентов используются системы раствори телей с возрастающей концентрацией аце­тонитрила (CH₃CN). Состав подвижной фа­зы а следовательно, и качество разделения

3. оптимизируют с помощью программиру­емых градиентных смесителей.