Тема 3.

Энергопотребление как определяемое дыханием

(через поступление кислорода в организм животного)

Вспоминаем:

Для транспорта кислорода нужен переносчик, иначе доля полезной массы в перекачиваемой жидкости (воде) – 5 г на тонну.

Полезно проверить это значение (и другие далее – в качестве подготовки к контрольной работе):

(Д) растворимость 7 мл O2 (г)/литр при равновесии с атмосферным воздухом (21% = 150 Торр), тогда примерно 5 мл O2 (г)/литр при смешивании с воздухом легких (100 Торр после смешивания) и т.д.

Доля полезной массы значительно возрастает за счет связывания (с миоглобином или гемоглобином), но она остается относительно низкой (200–250 г на тонну – по оценке предшествующего семинара)

Это объясняет близкие зависимости энергопотребления (организованного как обеспечивающее потребление кислорода) у различных животных – основной обмен (в зависимости от массы – см. выше или в справочных данных) и метаболический диапазон (см. ниже). Но не сам вид этих зависимостей! (вернемся к обсуждению в курсе «Биофизика»)

(Д) по факту переносчик – гемоглобин (М.м 68 000 Да), который представляет собой объединение 4-х молекул миоглобина (М.м. 17 000 Да), по сути, модифицированный тетрамер миоглобина. Это означает, что он не увеличивает связывание на единицу массы перекачиваемой жидкости (в сравнении с миоглобином), а обеспечивает какой-то другой эффект.

Какой же?

Количество перенесенного кровеносной системой и использованного кислорода дает баланс поступления кислорода в кровь и его отдачи в тканях, что можно представить/выразить как разность количеств кислорода на входе и на выходе из них

,

где W – объем, перекачиваемый кровеносной системой в единицу времени, c – концентрация гемоглобина в единице объема (с пересчетом в количество переносимого кислорода при насыщении гемоглобина). Y(P) – зависимость насыщения гемоглобина от парциального давления кислорода в равновесии с кровью при контакте с внешней средой в органах дыхания (на выходе артериальной крови из них, индекс «a») и в контакте с потребляющими тканями (на выходе из них, т.е. в венозной крови, индекс «v»).

При этом от величин P_a и P_v зависят скорости поступления кислорода на других этапах (см. далее)

В силу такой зависимости эффекта переноса (кислорода связанного с гемоглобином) от Y важно не только то, сколько кислорода содержит артериальная кровь, насыщаемая при контакте с кислородом из внешней среды в органах дыхания (ее определяет насыщение Y(P_a)), но и способность отдавать кислород при давлении в капиллярах. Если величина Y(P_v) велика, то кровь будет плохо отдавать кислород.

Иными словами, для гемоглобина (как переносчика) желательно возможно большее значение Y = Y(P_a) – Y(P_v) при обычных условиях.

Гемоглобин как переносчик решает именно эту задачу.

Проверяем:

(Д) кривые насыщения миоглобина и гемоглобина (БХФ, с. 104): миоглобин хорошо связывает, но плохо отдает (если в венозной крови давление не падает почти до нуля, а не может, т.к. нужно еще обеспечить диффузию к местам потребления – в митохондрии)

Миоглобин (мономер связывающего белка/переносчика) и гиперболическое связывание – плохо с точки зрения отдачи в тканях.

Для транспорта важен конечный эффект переноса на одну молекулу переносчика, который определяет разность принятого и отданного кислорода.

Для переносчика желательна сигмоидная кривая – аналогично той, которую обсуждали применительно к регуляции во Введении–1.

Вспоминаем: рассматривалось связывание фермента или активного макромолекулярного комплекса с несколькими одинаковыми молекулами (кооперативное связывание) как способ регуляции молекулярной активности.

Получаемые свойства регулируемых процессов представляют кривые связывания – зависимости скорости процесса от концентрации молекул регулятора.

Например, при кооперативном связывании регулятора (c) с ферментом (E) по схеме

…

при наличии 4-х центров связывания было получено выражение для относительной доли активной формы фермента, связанного с 4-мя молекулами регулятора (Ec₄)

Y = [Ec₄]/ [E] + [Ec] + [Ec₂] + [Ec₃] + [Ec₄] =

= K₄K₃K₂K₁c⁴/(1 + K₁c + K₂K₁c²+ K₃K₂K₁c³+ K₄K₃K₂K₁c⁴),

которая при малых концентрациях регулятора пропорциональна 4-й степени этого регулятора и выходит на насыщение при высоких концентрациях регулятора. В этом случае вторая производная Y’’ по концентрации регулятора изменяет знак с положительного на отрицательный. Говорят, что такая кривая имеет S-образный или сигмоидный вид (подобно наклоненной и вытянутой вправо латинской букве S).

(Д) у кривой насыщения гемоглобина действительно сигмоидная форма

С чем связана сигмоидная форма?

Механизм связывания при транспорте кислорода кровью

Транспорт кислорода кровью осуществляется за счет его обратимого связывания со специальным белком – гемоглобином. В капиллярах легких гемоглобин присоединяет кислород, в капиллярах потребляющих тканей отдает его.

связывание позволяет значительно увеличить количество кислорода в объеме крови (см. далее)

При организации транспорта кислорода кровью так же, как и во многих схемах регуляции молекулярной активности, использовано кооперативное связывание. Гемоглобин имеет 4 места связывания для кислорода, т.е. максимально связывает 4 молекулы кислорода, что представляет схема.

,

где E – свободный гемоглобин, а S – кислород.

Иными словами, при регуляции (вспоминаемой выше по Введению–1) и при транспорте кровью схема связывания одинакова (при заданном числе присоединяемых молекул, которых 4 для гемоглобина) и желательные свойства кривых связывания очень похожи.

Аналогия переносчика с «идеальным переключателем»: желательно, чтобы Y(P_a) = 1 и Y(P_v) = 0.

Вид кривой насыщения гемоглобина

При транспорте кислорода все состояния вносят вклад, пропорциональный числу присоединенных молекул (свободное состояние E вносит нулевой вклад). Общий эффект связывания представляет степень насыщения гемоглобина, как отношение количества связанного кислорода Y по отношению к максимально возможному связыванию.

Для рассматриваемой схемы связывания степень насыщения

Насыщение гемоглобина принято выражать в зависимости от парциального давления кислорода в равновесии с кровью P, а не от концентрации кислорода в растворе (кровь, тканевая жидкость и т.п.) непосредственно (которая пропорциональна давлению P в соответствии с растворимостью для данной среды и температуры). Давление кислорода в газовой фазе удобнее измерять, зачастую она известна, как заданная некоторыми условиями, например, давление кислорода в воздухе (21%, т.е. 21 кПа). Если использовать такую конвенцию, то аналогично через давления естественно выражать и диффузионные потоки.

Кривая насыщения гемоглобина, как зависимость количества связанного кислорода Y(P) (в сравнении с максимально возможным связыванием) от концентрации кислорода P (используемой вместо S, если определять степень насыщения указанным образом/ в зависимости от парциального давления кислорода), имеет вид (рис. кривые насыщения гемоглобина и миоглобина БФХ = «Биофизическая химия», с. 104).

;

где константы равновесия определены K_i = k_i/k_–i. в соответствии со схемой связывания выше (получение зависимостей такого рода и их свойства подробнее обсуждались в части 1)

Математическое выражение для кривой насыщения гемоглобина предполагает более широкие возможности, чем узко сигмоидный вид (в частности, за счет подбора констант кривую можно изменить и противоположным образом)

= есть дополнительные степени свободы (в сравнении с гиперболой)

(И) практическая математика: как сравнить две существенно разные математические зависимости?

Чем кривая насыщения гемоглобина отличается от гиперболического связывания?

(М) микроскопические константы связывания

Как использованы эти степени свободы?

Кривая насыщения имеет сигмоидный вид.

Подробнее.

Выражение для кривой насыщения гемоглобина, учитывающее число микросостояний (комбинаторику) [Биофизическая химия, с. 106]

При равенстве микроскопических констант (K_i = K) получаем полный куб в числителе и полную четвертую степень в знаменателе. После сокращения получаем ту же гиперболическую зависимость, что и при связывание переносчика с одной молекулой как для миоглобина.

Иными словами, сигмоидный вид требует прогрессирующей тенденции связывания кислорода с гемоглобином, чтобы от первой связываемой молекулы к четвертой сродство возрастало, т.е. возрастания от K₁ к K₄.

Константы равновесия (связывания) могут различаться более, чем на 2 порядка (например, [«Биофизическая химия», с. 106]: возрастание от K₁ до K₄ с характерными значениями K₁ = 0,025 Торр^–1, K₄ = 7 Торр^–1), что и объясняет наблюдаемую зависимость. Как уже говорили, ее называют сигмоидной или S-образной (из-за характерного перехода кривой от выпуклости вниз при малых значениях аргумента к выпуклости вверх, т.е. изменением знака второй производной).

как эквивалент обычной для теплокровных животных (сигмоидной) кривой насыщения используют уравнение Хилла

(Д)

Кривую насыщения гемоглобина (при характерном для теплокровных животных соотношении констант, обсуждение для холоднокровных – см. ниже) можно приближенно представить уравнением Хилла, т.е. зависимостью вида

Y=pⁿ/(Kⁿ+pⁿ), n = 2,8

хотя при низких концентрациях кислорода кривая насыщения, вроде бы, имеет совсем другой вид (почти кубическая парабола), чем для гемоглобина (для которого она линейна)

(Д) для человека и животных с близкой массой, значение K находится в диапазоне 3–4 кПа.

(М) проверки (контроля) качества описания: наложение зависимости Хилла на кривую насыщения в общем случае при наблюдаемых значениях констант связывания

Иллюстрация с подбором при значениях констант из БФХ (по исходной зависимости, уравнению Хилла + наиболее близкая к исходной гиперболическая кривая – как имитация возможностей приблизиться к наблюдаемому виду за счет одного связывания).

Результат сравнения (по данным из БФХ, с. ): зависимости практически совпадают (точнее, есть существенное различие при малых концентрациях кислорода, но рабочая область как значения P_a и P_v, см. ниже, находятся в другом диапазоне).

Иными словами, уравнение Хилла хорошо описывает реальную зависимость, если не рассматривать малые концентрации, где кривая насыщения линейна.

Таким образом, уравнение Хилла фиксирует соотношение констант связывания (и степеней свободы).

Иными словами, сигмоидность кривой насыщения в данном случае выражает возможность приближенно описать ее уравнением Хилла

Связь по кривой насыщения дают основные этапы переноса кислорода – поступление в ткани, перенос системой кровообращения, который уже обсуждали), поступление в кровь из легких (в органах дыхания).

Поступление кислорода в ткани

Диффузионный поток из капилляров в митохондрии клеток, прилегающих к кровеносным сосудам, имеет вид J = a (P – P₀), где P₀ – это давление кислорода в митохондриях, P – давление кислорода в капиллярах, через которые главным образом происходит снабжение кислородом. Более крупные сосуды не имеют достаточного доступа к снабжаемым клеткам из-за малой поверхности и большой толщины стенок. По длине капилляра вдоль потока величина P изменяется от P_a до P_v.

Величину a определяет геометрия сосудистой системы в потребляющей ткани – вместе с коэффициентом диффузии (эффективным – с учетом вклада миоглобина как переносчика), которому пропорционален поток, т.е. a = a*D.

А критическое значение давления в митохондриях P_0,c (при котором концентрация кислорода еще не лимитирует его потребление в митохондриях) очень мало (меньше порядка 0,1 Торр [Kayar?]).

Необходимость снабжать клетки на всем протяжении капилляров означает, что величина P_v на выходе крови из потребляющих тканей должна обеспечить наблюдаемую величину энергопотребления, т.е. необходимо выполнение условия

J = a (P_v – P₀)

градиент О₂ в тканях (зависимость кривой насыщения гемоглобина от размера животного)

Критическое значение давления, обеспечивающего диффузию можно оценить. Пример такой оценки дает следующая задача.

Число капилляров на единицу площади поперечного сечения мышцы составляет у мыши и лошади соответственно 2000 и менее 1000 штук на мм² (Шмидт-Ниельсен, с. 118). Какая разность концентраций О₂ между тканью и капиллярами возникает при интенсивной нагрузке, когда энергетический обмен в мышце возрастает в десятки раз (можно говорить даже о 100-кратном увеличении) по сравнению с обменом в покое, который в зависимости от массы тела m составляет для теплокровных организмов 0,7 m^–1/4 (л O₂ кг^–1ч^–1). Можно ли как-то оценить физиологическую значимость полученного результата (иными словами, с чем нужно сравнивать полученное значение)? Коэффициент диффузии для кислорода в воде составляет 2,6 10^–5 см²/с. Диаметр капилляра 8 мкм. /4,5 мкм по данным для многих животных и различных типов мускулатуры [Kayar et al, 1992]

Решение. При 2000 штук капилляров на мм² у мыши площадь, приходящаяся на капилляр, составляет 500 мкм², которой соответствует круг (или близкая гексагональная структура) радиусом R=13 мкм. Диффузию при цилиндрической симметрии описывает уравнение J = S D dc/dr = l 2r D dc/dr. Оценку разности концентраций О₂ между тканью и капилляром (c) можно получить, считая, что поток не зависит от радиуса (т.е. диффузионный перенос происходит на расстояние R. Требуемый поток J определяем для мыши (массой 1/81 кг), исходя из заданного аллометрическими уравнениями потребления на единицу объема, откуда J = i V = I l R². dc = i R²/2D dr/r. Интегрируя, получим разность c = i R²/2D ln(R/r) = 0,7/3 л О₂ (л ткани час)^–1 169 10^–12/5,2 10^–9 с ln(13/4)= 30 мкл О₂/л. При возрастании нагрузки в 100 раз получим величину 3 мл О₂/л, что составляет почти половину концентрации растворенного кислорода при его обычной концентрации в воздухе 21%. Следовательно, при больших нагрузках транспорт кислорода в ткани ограничивает диффузия и это является причиной, по которой частота капиллярной сети столь высока (а ее объем составляет значительную часть объема мышечной ткани, а именно, всего лишь на порядок меньше последнего).

Сделанную оценку можно видоизменить, считая, что потребление пропорционально объему ткани, или уточнить, исходя из реального распределения митохондрий.

Поступление кислорода в кровь из легких

Аналогично поступление кислорода из легких в кровь пропорционально разности концентраций кислорода в легких и крови, прокачиваемой через легкие. Поток J = b (P_A – P), где давление P изменяется от P_v до P_a.

P_A – давление в легких, которое формально изменяется в цикле вдоха-выдоха (от 21% до 18% в покое и от 21% до 16% при нагрузке – если не учитывать эффект разбавления за счет воздуха мертвого пространства).

Но реально это значение меньше и почти не изменяется в цикле (подумайте, почему?) – около 100 Торр (т.е. 14%).

Величина b может быть представлена как b = b_S S, где S – площадь поверхности легких (эффективная, если поверхность непосредственного контакта изменяется). Величина b_S в отличие от величины a, обсуждаемой для поступления кислорода в потребляющей ткани определена как отнесенная на единицу площади, но аналогична ей в том смысле, что также пропорциональна коэффициенту диффузии, т.е. b_S = b_S*D.

По аналогии с этапом поступления в ткани

J = b (P_A – P_a)

(М) уравнение Хилла удобно использовать как эквивалент реальной кривой насыщения (учитывая наблюдаемое вырождение – связь констант связывания): тогда два параметра – постоянный (показатель степени n = 2,8) и «адаптивный» = сдвиг кривой насыщения «вправо» (увеличение K) или «влево» (уменьшение K)

Значение K – давление «полунасыщения» = давление, при котором Y = ½.

Иными словами, изменение кривой насыщения можно представить как изменение (сдвиг) значения давления (O₂)_1/2 при Y = 0,5 (т.е. отвечающего полунасыщению), определяемому по уравнению Хилла или графически.

Такой сдвиг кривых действительно происходит, если изменять состав среды (крови), изменяя pH, содержание углекислоты, фосфатов, особенно дифосфоглицерата (ДФГ).

Экофизиологическое приложение:

Объяснение изменения «адаптивного» параметра K у животных в зависимости от условий среды:

(М) необходимость обеспечить поступление кислорода к местам потребления (в митохондрии) как диффузионный поток выполнено условие I ~ P_v (P₀ критическое близко к нулю – в обычном масштабе давлений кислорода). Точнее i = I/m ~ P_v , т.к. обустройство транспорта относится не к животному в целом, а является удельной характеристикой, отнесенной к единице площади (как число капилляров на единицу поперечного сечения) или объема, если учитывать длину капилляра и изменение давления по его длине. И обратно P_v ~ i (при прочих равных условиях)

(Г) обустройство локальной геометрии, в частности, плотность капилляров на единицу поперечного сечения, изменяется значительно меньше, чем значение i

Подтверждение:

(Д) число капилляров на единицу поперечного сечения мышцы для мыши и лошади – ОЖ, с.

• холоднокровные – нет сигмоидной формы у рыб (при низких температурах), т.к. при той же массе обмен холоднокровных в десятки раз меньше, чем у теплокровных (в 20 раз при температуре тела 20^оС и почти в 100 раз в холодной воде около 0^оС)

(Д) температурная зависимость энергопотребления холоднокровных на примере колорадского жука демонстрирует, что относительное увеличение при изменении температуры на 10 градусов Q₁₀ = 2–2,5 (ФЖ, с. )

• холоднокровные – у рептилий (на примере варана) при увеличении температуры от 25 до 36^оС (на верхнем пределе отличие от потребления теплокровных лишь в несколько раз) сигмоидность возрастает (статья Clark+)

• в условиях высокогорья – сдвиг «влево», т.к. кривую насыщения с теми же свойствами (полное насыщение для P_a или P_A и достаточное для потока в потребляющие ткани значение P_v) нужно «вписать» в более узкий диапазон давлений

• материнский организм (на примере козы – ФЖ, с. ) в сравнении с плодом (который находится «дальше» от атмосферы)

• в зависимости от массы – сдвинут «вправо» для животных меньшей массы, т.к. значение P_v должно обеспечить значительное большее значение потребления (i)