Станция 11 «выделение чистой культуры аэробов (1 - 2 день исследования)»

Шаг 1

Первый день: Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить, внести в пробирку с исследуемым материалом, прикоснутся кончиком петли к материалу

Шаг 2

левой рукой приоткрывают один край чашки, вводят петлю внутрь

Шаг 3

у противоположного края делают петлей несколько штрихов в одном месте

Шаг 4

петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5-6 мм.

Шаг 5

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки и поставить в штатив. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов.

Шаг 6

Второй день: Изучение культуральных признаков: описать выросшие колонии

Шаг 7

Изучение морфологических признаков: Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить и из ½ колонии приготовить фиксированный мазок, окрасить по Граму, микроскопировать, определить форму микроорганизма и расположение бактерий, тинкториальные признаки.

Шаг 8

Выделение чистой культуры – Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки, остудить, оставшуюся ½ колонии пересеять на скошенный агар.

Шаг 9

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки и поставить в штатив

Шаг 10

Посевы инкубируют в термостате при 37С 18 – 24ч.

Шаг 1

Третий день: Изучение чистоты выделенной на скошенном агаре культуры: приготовить фиксированный мазок, окрасить по Граму, микроскопировать, определить форму и расположение микроорганизмов,

тинкториальные свойства.

Шаг 2

Изучение биохимических признаков: выбрать тесты для идентификации, произвести постановку этих тестов.

Шаг 3

Постановка теста на чувствительность выделенной культуры

к антибиотикам

Шаг 4

Четвертый день: Идентификация выделенной культуры: учет результатов тестов.

Шаг 5

Учет результатов определения чувствительности выделенной культуры

к антибиотикам

Шаг 6

Заполнение и выдача результата бактериологического исследования и антибиотикограммы.

Шаг 1

Пробирку со средой Китта-Тароцци прогреть на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин, охладить до 30-37⁰С.

Шаг 2

Простерилизовать бактериальную петлю в пламени горелки.

Шаг 3

Стерильной бактериальной петлей взять каплю исследуемого материала.

Шаг 4

Засевают в пробирку со средой Китта-Тароцци.

Шаг 5

Инкубация в анаэробных условиях: в СО₂ инкубаторе, в эксикаторе или анаэростате при температуре 37⁰С на 24-48 часов.

Шаг 6

Второй день. Просматривают посевы, при помутнении среды с придонным ростом бактерий и газообразовании приготовить мазки.

Шаг 7

Мазки окрасить по Граму, микроскопия

Шаг 8

Результат микроскопии. Под микроскопом в мазках видны крупные споровые грамположительные палочки

Шаг 9

Пересев материала с Китта-Тароцци на кровяной сахарный агар и в столбик сахарного питательного агара в пробирке, железосульфитный агар (среда Вильсон-Блера).

Шаг 10

Посевы инкубируют в анаэробных условиях: в СО₂ инкубаторе, в эксикаторе или анаэростате при 37⁰С в течение 48-72 часов.

Шаг 1

Просмотр выросших колоний на кровяном сахарном агаре, высоком столбике сахарного агара в пробирке и Вильсон-Блера среде после инкубации.

Шаг 2

Пересев типичных колоний на среду Китта-Тароцци или тиогликолевую среду (получение чистой культуры).

Шаг 3

Инкубация в строго анаэробных условиях в термостате при 37⁰С в течение 24-48 часов.

Шаг 4

После инкубации идентификация чистой культуры по биохимическим признакам традиционными методами или с помощью тест-систем для определения специфических бактериальных ферментов или метаболитов.

Шаг 5

Определение продукции факторов вирулентности: серологическая идентификация экзотоксинов в реакции нейтрализации

Шаг 6

Определение чувствительности к антибиотикам в строго анаэробных условиях.

Шаг 7

Окончательный результат.

Шаг 1

Градуированной пипеткой внести на поверхность питательной среды взвесь микроорганизмов в объеме 0,5 мл. Использованную пипетку поместить в дезинфицирующий раствор

Шаг 2

Стерильным бактериологическим шпателем распределить по поверхности агара. Использованный шпатель поместить в дезинфицирующий раствор

Шаг3

Приоткрытые чашки подсушить в течение 10 мин.

Шаг 4

Стерильным пинцетом внести диски с антибиотиками, не более 6 дисков на чашку диаметром 100 мм. Расстояние между дисками 20 мм

Шаг 5

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 18-24 часа

Шаг 6

Учет результатов. При положительном результате вокруг диска с антибиотиком будет зона задержки роста микроорганизмов. При отрицательном результате вокруг дисков зона задержки роста микроорганизмов не будет

Шаг 1

На поверхности обезжиренного стекла карандашом на расстоянии друг от друга нарисовать 3 кружочка

Шаг 2

В 1-ый и 2-ой кружок внести по 1 капле диагностической агглютинирующей сыворотки стерильной пипеткой. В 3-ий кружок внести 1 каплю физиологического раствора

Шаг 3

Бактериологическую петлю простерилизовать над пламенем горелки, остудить, взять с поверхности агара культуру, внести в 1-ую каплю, размешать круговыми движениями.

Шаг 4

Бактериологическую петлю простерилизовать над пламенем горелки, остудить, взять с поверхности агара культуру, внести в 3-ю каплю с физиологическим, размешать круговыми движениями.

Шаг 5

Бактериологическую петлю простерилизовать, поставить в штатив.

Шаг 6

Инкубация при комнатной температуре 2-5 мин. Учет результатов. При положительном результате в 1-ой капле будет видны хлопья агглютината, вторая капля (отрицательный контроль) прозрачная, 3 3-ей капле (контроль антигена) равномерная муть.

Шаг 1

В стерильную пробирку внести 2,4 мл 0,9% р-ра натрия хлорида, добавить 0,1 мл исследуемой сыворотки (рабочее разведение сыворотки). Инактивировать на водяной бане при температуре 56⁰С в течение 30 мин;

Шаг 2

закапать в пробирку 4 капли 50% формалинизированных эритроцитов и поставить в термостат на 30 минут или при комнатной температуре на 1 час, или на ночь в холодильник.

Шаг 3

Центрифугировать при 2000 об/мин в течение 15 минут.

Шаг 4

Установить в штатив 7 пустых пробирок (5 из них опытные, остальные контрольные: КС - контроль сыворотки, КД - контроль диагностикума). Подписать на пробирках номер и разведение сыворотки.

Шаг 5

Внести, начиная со 2-й пробирки, во все по 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия.

Шаг 6

Внести в 1-ю, 2-ю и в контроль сыворотки по 0,5 мл рабочего разведения сыворотки.

Шаг 7

Исследуемую сыворотку титровать, перенести по 0,5 мл из пробирки в пробирку, из 5-ой пробирки 0,5мл выливают в дез. раствор Таким образом получают ряд двухкратных разведений сыворотки: 1:100, 1:200, 1:400, 1:800.

Шаг 8

Затем во все пробирки, кроме КС, добавить по 0,5 мл диагностикума бруцеллезного.

Шаг 9

Приготовить рабочее разведение диагностикума: развести до рабочего титра 1:10 (0,4 мл концентрированного диагностикума + 3,6 мл 0,9% р-ра натрия хлорида)- контроль диагностикума.

Шаг 10

Тщательно встряхнуть пробирки, поставить в термостат при 37⁰С на 24 часа.

Шаг 11

Произвести учет результатов реакции: положительный результат реакции агглютинации характеризуется образованием на дне пробирки крупно-хлопчатого осадка с прозрачной надосадочной жидкостью.

Шаг 1

Подготовить ингредиенты реакции: антиген 1 – неспецифический антиген (липиды из мышцы сердца быка), 2 и 3 – специфические антигены трепонемы, инактивированная исследуемая сыворотка, изотонический раствор хлорида натрия, комплемент в рабочей дозе, гемолитическая система и пронумеровать 4 пробирок (1-я, 2-я, 3-я, 4-я (контроль)).

Шаг 2

Внесение исследуемой сыворотки во все пробирки по 0,1 мл.

Шаг 3

Внесение изотонического раствора натрия хлорида по 0,4 мл в 1-, 2- и 3-ю пробирки и по 0,9 мл в 4-ю пробирку.

Шаг 4

Внесение 0,5 мл неспецифического антигена 1 в 1-ю пробирку

Шаг 5

Внесение 0,5 мл специфического антигена 2 во 2-ю пробирку

Шаг 6

Внесение 0,5 мл специфического антигена 3 во 3-ю пробирку

Шаг 7

Внесение комплемента по 0,5 мл во все пробирки, гомогенизировать.

Шаг 8

Инкубация в термостате при 37⁰С в течение 45 мин.

Шаг 9

Добавление гемолитической системы по 1,0 мл во все пробирки. Встряхивают и выдерживают 40-60 мин при 37⁰С в термостате

Шаг 10

Учет результатов. В первых трех пробирках «положительная реакция» +++ - полная задержка гемолиза (жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно. «отрицательная реакция» «-» - гемолиз (полный лизис эритроцитов, жидкость окрашена (лаковая кровь)).

Шаг 1

На поверхности обезжиренного стекла карандашом нарисовать кружок диметром 15-20 мм

Шаг 2

В центр кружочка вносят материал больного петлей круговыми движениями.Бактериологическую петлю простерилизовать, поставить в штатив.

Шаг 3

Мазок подсушивают над пламенем горелкив теплой струе воздуха до полного высыхания

Шаг 4

На подсушенный мазок вносят 2-3 капли диагностической сыворотки против хламидий

Шаг 5

Инкубация в влажной камере в термостате при 37˚С 30 мин

Шаг 6

Промывают препарат промывочным раствором

Шаг 7

На мазок вносят 2-3 капли антивидовой флюоресцирующей сыворотки

Шаг 8

Инкубация в термостате при 37˚С 30 мин

Шаг 9

Промывают препарат промывочным раствором

Шаг 10

Вносят 1 каплю иммерсионного масла, микроскопируют.

Учет результатов: при положительном результате в мазке будет обнаруживаться зеленовато желтое свечение на темном фоне. При отрицательной реакции все поля зрения при микроскопии будут темными без свечения.

Шаг 1

Приготовить рабочее разведение исследуемой сыворотки 1:5 : в стерильную пробирку градуированной пипеткой внести 1 мл исследуемой сыворотки и 4 мл стерильного физиологического раствора, перемешать пипетированием

Шаг 2

В 6 лунок внести физиологический раствор 1 мл и отдельно в 2 лунки для контролей

Шаг 3

Градуированной пипеткой набрать 1 мл из разведения 1:5 и внести в 1-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:10

Шаг 4

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 1-ой лунки и внести во 2-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:20.

Шаг5

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 2-ой лунки и внести во 3-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:40.

Шаг 6

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 3-ей лунки и внести во 4-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:80.

Шаг 7

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 4-ой лунки и внести во 5-ю лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:160.

Шаг 8

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл смеси из 5-ой лунки и внести во 6-ую лунку перемешать пипетированием. Над лункой подписать разведение 1:320.

Шаг9

Взять новую градуированную пипетку, набрать 1 мл рабочего разведения сыворотки 1:5 внести в 1-ую контрольную лунку перемешать пипетированием

Шаг10

Взять новую градуированную пипетку, внести в каждую лунку по 0,5 мл взвеси эритроцитарного антительного HBs-диагностикума, кроме контрольных.

Шаг 11

Взять новую градуированную пипетку, набрать 0,5 мл взвеси эритроцитарного антительного HBs-диагностикума внести в 2-ую контрольную лунку перемешать пипетированием с физиологическим раствором

Шаг 12

Инкубирование в термостате при 37˚С 60 мин.

Шаг 13

Учет результатов: при положительной реакции на дне лунок образуется мелкозернистый осадок по всей поверхности в виде «зонтика». При отрицательном результате осадок с ровными краями, в виде «пуговки»

Шаг 1

В три лунки микропланшета внести исследуемую сыворотку

Шаг 2

В следующий ряд в три лунки внести сыворотку с антителами к ВИЧ (положительный контроль)

Шаг3

В следующий ряд в три лунки внести сыворотку без антител к ВИЧ (отрицательный контроль)

Шаг 4

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 1 часа

Шаг 5

Промыть все лунки промывочным раствором 5 раз

Шаг 6

Внести во все лунки антиглобулиновую сыворотку меченную ферментом пероксидазой (конъюгат)

Шаг 7

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 1 часа

Шаг 8

Промыть все лунки промывочным раствором 5 раз

Шаг 9

Внести во все лунки субстрат для фермента пероксидазы - хромоген

Шаг 10

Инкубация в термостате при 37ºС в течение 30минут

Шаг 11

Внести во все лунки стоп реагент

Шаг 12

Анализ оптической плотности раствора в микропланшетев считывающих аппаратах – риддеры. При положительной реакции раствор в лунках окрашивается в желтый цвет, при отрицательной реакции – бесцветная. Окончательные результаты выдает риддер – цифровые показатели оптической плотности раствора в лунках