44.Известен способ определения T-лимфоцитов в крови, включающий в себя выделение лимфоцитов, добавление к ним эритроцитов барана, инкубацию не менее одного часа при температуре 4oC, приготовление препаратов и их анализ по числу прикрепившихся эритроцитов [1] За T-лимфоциты принимают клетки, прикрепившие не менее трех эритроцитов барана. Однако данным методом можно определять только количество T-лимфоцитов, без определения их активности в организме.
Известен также способ определения активированных T-лимфоцитов в крови человека, включающий культивирование лимфоцитов 48 54 часа в питательной среде с митогеном фитогемагглютинином (ФГА), стимулирующим к пролиферации в условиях культуры преимущественно T-лимфоциты, введение колхицина, останавливающего деление лимфоцитов на стадии метафазы, приготовление препаратов хромосом и их цитогенетический анализ [2] Данный метод основан на анализе в лимфоцитах, проходящих первое митотическое деление, ассоциаций акроцентрических хромосом, являющихся цитогенетическим следом (признаком) их предшествующей пролиферации и миграции из периферических лимфоидных органов в организме человека. За активированные принимаются лимфоциты без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками, образовавшиеся в результате серии митотических делений, при которых разрушаются ассоциации. Данный метод является достаточно сложным (необходимо культивировать лимфоциты в стерильных условиях, останавливать деление клеток колхицином, так как хромосомы можно изучать только на стадии метафазы митоза), малодоступным для массового внедрения (необходимы дефицитные реактивы, дорогостоящее оборудование), а также требуется определенная квалификация исполнителя (значение культуры клеток, владение цитогенетическим методом). Данный метод недостаточно объективный, так как в культуре часть лимфоцитов погибает и не все из живых лимфоцитов вступают в митотический цикл на период фиксации клеток.
Целью предложенного способа является повышение объективности оценки, упрощение определения и сокращение времени анализа функциональной активности лимфоцитов непосредственно в организме человека.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем определение активности лимфоцитов по остаточным признакам их антигензависимой активации и пролиферации в периферических лимфоидных органах, осуществляют спонтанное розеткообразование с эритроцитами барана без холодовой инкубации ("немедленные розетки"), в препарате учитывают количество прикрепившихся эритроцитов барана к T-лимфоцитам (авидность), и по количеству T-лимфоцитов, прикрепивших более 10 эритроцитов барана, определяют активированные.
Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что число активированных T-лимфоцитов определяют путем анализа авидности T-лимфоцитов к эритроцитам барана в мазке, приготовленном при постановке спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана без ходовой инкубации ("немедленные розетки"). За активированные принимаются T-лимфоциты, прикрепившие более 10 эритроцитов барана. Следовательно, полученный образце лимфоцитов не надо культивировать, кроме того, объем его может быть минимальным (0,5 0,6 мл) и позволяет объективно выделить лимфоциты из цельной крови для розеточных тестов, что значительно упрощает метод и делает его доступным для скренирующих исследования. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию "новизна".
Известны технические решения постановки метода спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана без холодовой инкубации ("немедленные розетки") (2, 4, 5). Однако в указанных технических решениях (3, 4, 5) не был выделен и функционально обоснован авидный класс T-лимфоцитов, прикрепивший более 10 эритроцитов барана, что не позволяло достичь поставленной цели, а именно выделить активированные T-лимфоциты в организме. Поэтому способы (3, 4, 5) постановки и анализа "немедленных розеток" являются количественными, а не качественными.
Неизвестны технические решения, в которых активность лимфоцитов в крови определяют по числу прикрепившихся к ним эритроцитов барана при немедленном способе постановки розеток. Определение активированных T-лимфоцитов розеточным тестом без их холодовой инкубации по доле высокоавидных к эритроцитам барана лимфоцитов (прикрепивших более 10 эритроцитов барана) в препарате не следует явным образом из известного уровня техники. Исходя из этого, заявляемое решение соответствует требованию "изобретательского уровня".
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови из пальца или вены в пробирки с антикоагулянтами, выделяют лимфоциты, доводят их концентрацию до 2,0106 клеток на 1 мл питательной смеси, состоящей из среды 199 и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, адсорбированной против эритроцитов барана и человека, инактивированной при 56oC 30 мин. Затем 0,1 мл полученной взвеси лимфоцитов смешивают с 0,1 мл 0,5% взвеси отмытых эритроцитов барана, разведенных в той же питательной среде, что и лимфоциты. Клетки инкубируют в термостате 10 мин при 37oC, центрифугируют при 200 5 мин, фиксируют розетки добавлением 0,05 мл 3% раствора глютарового альдегида (pH 7,2 7,4) в течение 20 мин при комнатной температуре, отмывают от фиксатора избытком дистиллированной воды и центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, оставляя объем 0,1 0,2 мл, в котором клетки тщательно ресуспендируют и приготавливают мазки на обезжиренных предметных стеклах. Мазки фиксируют 5 мин в метаноле, окрашивают и микроскопируют. В препарате изучают до 400 лимфоцитов в четырех разных участках препарата. Розеткообазующие лимфоциты группируют в три авидных класса: 1 класс 3 6 прикрепившихся эритроцитов барана, 2-й класс 6 10 и 3-й класс более 10 эритроцитов барана. По доле последнего класса определяют активированные T-лимфоциты на момент взятия образца крови на анализ.
Основанием для утверждения, что субпопуляция циркулирующих лимфоцитов, присоединяющих более 10 эритроцитов барана, является субпопуляцией активированных лимфоцитов, служат данные об их определенной динамике у здоровых и больных лиц (см. таблицу), а также обнаруженная высокая (r 0,8 - 0,9) положительная корреляция этой доли лимфоцитов с частотой классов лимфоцитов без ассоциация и с двумя ассоциирующими акроцентриками. Согласно прототипу указанные цитогенетические классы лимфоцитов также являются активированными антигенами, образовавшимися в периферических лимфоидных органах после серии митотических делений при иммуногене. Высокая положительная корреляция сравниваемых показателей, полученных разными способами, свидетельствует об однородности анализируемых субпопуляций среди циркулирующих лимфоцитов. Эти субпопуляции входят в состав постпролиферативного пула лимфоцитов, вновь образующихся в периферических лимфоидных органах при иммуногенезе в ответ на имеющиеся в организме многочисленные антигены и аутоантигены. Следовательно, эти лимфоциты являются активированными. После серии митотических делений (6-10 раз), активированные субпопуляции лимфоцитов мигрируют из периферических лимфоидных органов в общую циркуляцию и становятся доступными для анализа при взятии крови. При движении хромосом ассоциации хромосом разрушаются или их остается минимальное количество, то есть они составляют класс лимфоцитов без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками. Кроме того, во вновь образовавшихся T-лимфоцитах сохраняется высокая плотность мембранных СД 2-антигенов. Поэтому они являются высокоавидными к эритроцитам барана и при контакте с ними присоединяют более 10 эритроцитов барана. В длительно циркулирующих (дни, недели, месяцы) интактных лимфоцитах плотность СД 2-антигенов снижается, т.к. данный стадиодиференцированный антиген принимает участие преимущественно в процессах антигеннезависимой активации лимфоцитов. Следовательно, неактивированные (временно интактные) T-лимфоциты присоединяют меньшее число (<10) эритроцитов барана.
Частота активированных лимфоцитов среди циркулирующего пула лимфоцитов зависит от интенсивности их образования в перфиерических лимфоидных органах, а также от активности и направления их миграции к антигенным патологическим очагам, что отражено в приводимой таблице.
Изучалась частота активированных лимфоцитов с помощью заявляемого способа и прототипа у следующих контингентов лиц:
здоровые доноры 10 человек;
онкогенные больные с экссудативным плевритом канцерозной этиологии 9 человек.
В таблице представлены результаты частоты розеткообразующих T-лифоцитов, полученных по способу с холодовой инкубацией, характеризующих общее количество T-лимфоцитов, и без холодовой инкубации "немедленные розетки", характеризующие субпопуляции T-лимифоцитов с повышенной плотностью рецепторов к эритроцитам барана (СД 2 антиген).
Из таблицы видно, что общая частота "немедленных розеток" во всех образцах лимфоцитов значительно меньше, чем частота общих розеток и соответствует данным литераты [3] Без холодовой инкубации успевают образовать розетки только лимфоциты с повышенной плотностью рецепторов СД 2. Анализ частоты авидных классов в крови и плевральном экссудате показывает, что только высокоавидные T-лимфоциты, относящиеся к третьему классу, при немедленном способе постановки розеток проявляют характерную для данной иммунологической ситуации динамику. Так, частота лимфоцитов, прикрепивших более 10 эритроцитов барана в плевральном экссудате в 1,5 2 и более раз превышала частоту таких лимфоцитов в крови. Подобная динамика в крови и плазме была обнаружена и для класса лимфоцитов без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками (КЛ 0+2).
При коррелятивном анализе частоты КЛ 0 + 2 в крови и плазме выявлено, что данный цитогенетический показатель активности T-лимфоцитов достоверно высоко (r 0,82 и 0,85 соответственно) коррелирует только с частотой T-лимфоцитов, присоединивших более 10 эритроцитов барана в постановке метода розеткообразования без холодовой инкубации.
Такие различия активированных T-лимфоцитов в цитоннетическом и розеточном тестах в крови и плевральном экссудате возникли за счет их перераспределения, то есть миграции из крови и депонирования в легких, где локализуется мощный антигенный очаг (метастазы опухоли).
В крови здоровых доноров средняя частота "немедленных розеток" также ниже общих розеток и это снижение происходило за счет доли высокоавидных T-лимфоцитов третьего класса. Кроме того, между ними и частотой КЛ 0 + 2 имелась более тесная положительная корреляция.
Полученная динамика частоты высокоавидных к эритроцитам барана T-лимфоцитов и их тесная корреляция с частотой КЛ 0 + 2 подтверждают их иммунологическую активность. Следовательно, показатель частоты T-лимфоцитов, присоединивших более 10 эритроцитов барана в тесте "немедленных розеток", является функциональным тестом активности циркулирующих T-лимфоцитов. Суммарные показатели частоты розеткообразующих лимфоцитов с холодовой и без холодовой инкубации остаются количественными тестами и достоверно не коррелируют с функциональными показателями T-лимфоцитов.
Циркулирующие в организме T-лимфоциты, присоединившие более 10 эритроцитов барана, имеют большую плотность соответствующих рецепторов (СД 2-антигены), как остаточный признак их предшествующей активации в периферических лимфоидных органах. СД 2-антиген участвует в межклеточных контактах, обусловливая антигензависимую (неспецифическую) пролиферацию и дифференцировку комитированных лимфоцитов [6] Его комплементарность к эритроцитам барана, а следовательно, и связь с ними, случайна. Об этом свидетельствуют данные об увеличении авидности лимфоцитов (числа прикрепившихся эритроцитов барана) в процессе их неспецифической митогенной стимуляции лектинами в условиях культивирования в пробирке, уже через час после добавления митогена (фитогемагглютинина, конкаванавалина А, митогена лаконоса) еще в отсутствии синтеза ДНК [7, 8] Следовательно, увеличение плотности СД 2 антигена является ранним признаком активации T-лимфоцитов. В периферических лимфоидных органах лимфоциты после антигенспецифической и антигеннеспецифической активации трансформируются в бластные клетки с высокой плотностью СД2-антигена, а следовательно, и с высокой авидностью к эритроцитам барана. Затем такие лимфоциты митотически делятся 6 10 раз и дифференцируются в клон антигенреактивных T-лимфоцитов, которые покидают лимфоидный орган, включаясь в пул циркулирующих T-лимфоцитов. Вновь образовавшиеся T-лимфоциты сохраняют высокую плотность рецепторов СД 2 и становятся доступными для анализа при взятии образца крови. В ходе дальнейшего онтогенеза T-лимфоцитов плотность мембранного СД2-антигена снижается.
Таким образом, по динамике высокоавидных T-лимфоцитов, прикрепивших более 10 эритроцитов барана, определяют методом "немедленных розеток" и оперативно контролируют интенсивность пролиферации и миграции активированных T-лимфоцитов; их перераспределение в организме к местам депонирования антигенов; изучают напряженность иммунитета и его коррекцию с помощью иммунотропной терапии.
Метод розеткообразования для определения Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.
Принцип. Поверхностные рецепторы, специфичные для различных субпопуляций лимфоцитов, проявляются, связывая эритроциты, нативные или нагруженные антителами к этим рецепторам. Эритроциты образуют с поверхностью лимфоцита фигуру розетки. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший 3-5 эритроцитов. В ряде случаев эритроциты плотно окутывают лимфоцит, образуя так называемую морулу. Интерпретация этого феномена крайне разноречива. Нередко он отражает методические неточности постановки. Феномен розеткообразования может быть усилен путем обработки эритроцитов нейраминидазой.
Определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).
Принцип. Тимусзависимые Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: Erythrocyte — розеткообразующие клетки).
Приборы и оборудование. 1. Центрифуга ЦЛК-1. 2. Холодильник (бытовой). 3. Термостат. 4. Микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы). 5. Камера Горяева. 6. Счетчик клеток. 7. Автоматические пипетки или микропипетки. 8. Пробирки силиконированные или пластиковые. 9. Штатив для пробирок.
Реактивы. 1. Среда 199, раствор Хенкса. 2. Гепарин (готовят раствор из расчета 25 ЕД/мл крови). 3. Фосфатный буфер рН 7,4. 4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого. 5. 0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипанового синего на дистиллированной воде. 6. Гипак (изопак, верографин, уротраст). 7. Фиколл400 (полисахарид с молекулярной массой 400000). 8. Эритроциты барана.
Ход определения. 10 мл крови из локтевой вены вносят в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1:2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин. В связи с тем что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400 g. Величину центробежного ускорения G вычисляют по формуле: G= 1,1 *n2* R-10-5 (n — число оборотов в минуту, R — радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-гипака с разделяемой суспензией в см). После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором. Концентрацию клеток доводят до 2—4 млн. в 1 мл в "среде 199"', содержащей 10 % раствор телячьей сыворотки или сыворотки IV (АВ) группы крови человека. При использовании последней необходима инактивация при 56 °С в течение 30 мин и абсорбция эритроцитами. Для этого 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют Можно использовать любой буферный раствор рН 7,0—7,2 без ионов Ca++ (наличие ионов Ca++ способствует конгломерации клеток, их коагуляции). к 1 мл сыворотки и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, периодически встряхивая. Желательна абсорбция сыворотки пулом лейкоцитов, учитывая возможность наличия антилейкоцитарных антител. При использовании человеческой сыворотки необходимо учитывать влияние аутоцитолимфотоксинов, проявляющих максимум активности при 4°С. Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1 % раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением и 1—2 капли добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3.
Приготовление эритроцитов барана. Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 нед при 4 °С в растворе Олсвера (глюкоза — 2,05 г, цитрат натрия — 0,8 г, хлорид натрия — 0,42 г, дистиллированная вода—100 мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10 % раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3—4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5 % (по объему) взвесь клеток.
Подготовка и учет реакции розеткообразования. Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. в 1972 г. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5 % взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37 °С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 °С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева. Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакций в другой, свободной от постановки или менее загруженный, день. Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов барана, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови человека. Не исключено, что глутаровый альдегид десеквестрирует скрытые антигены в мембране бараньих эритроцитов, к которым имеются рецепторы у лимфоцитов человека. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение Т-лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями. Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01 % раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2—3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами. В день взятия крови на Т-лимфоциты необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать абсолютные значения Т-клеток. Нормальные величины Т-клеток, определенные у 150 здоровых доноров: 54,3 ± 0,98%; 979,8 ± 16,8 кл/мкл.
Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (ЕА-РОК). Все подготовительные операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 °С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) в течение 5 мин проводили подсчет Т-активных лимфоцитов способом, описанным выше для общих Т-клеток. Содержание Т-активных лимфоцитов у 150 здоровых доноров составило: 34,6± 1,92 %, 840 ± 123 кл/мл.
|
|
45.
46 Типы иммунного ответа. Иммунный ответ — это реакция организма на внедрение чуждых ему макромолекул. Вещество, способное вызвать специфический иммунный ответ, называется антигеном.
Иммуногенность антигена, т. е. способность вызывать иммунный ответ, зависит не только от его чужеродности, но и от молекулярной массы (молекулы массой менее 5000 обычно не иммуногенны), структурной гетерогенности, устойчивости к разрушению ферментами, вида животных.
В природе существует громадное множество антигенов животного, растительного и микробного происхождения. Они могут быть классифицированы по разным признакам, в том числе и по характеру специфичности (видовые, групповые, гетерогенные, стадиоспецифические в онтогенезе и др.). Примерами антигенов могут служить, в частности, антигены гистосовместимости, участвующие в распознании и устранении аномальных клеток организма или трасплантированных тканей; аллергены животного и растительного происхождения (пыльца, чешуйки кожи, волосы, перья и др.), вызывающие повышенную чувствительность организма; групповые антигены крови — глюкопротеиды, которые хотя и не вызывают образования антител в организме, но реагируют с ними in vitro.
Известны два основных типа иммунных ответов организма на антиген — гуморальный и клеточный. Ответ гуморального типа состоит в выработке антител, которые циркулируют в крови и специфически связываются с чужеродными организму молекулами. Иммунный ответ клеточного типа включает образование специализированных клеток, реагирующих с антигеном посредством его связывания и последующего разрушения. Клеточный иммунитет обращен в основном против клеточных антигенов — бактерий, патогенных грибов, чужеродных клеток и тканей (пересаженных или опухолевых).
Два основных типа иммунных реакций опосредуются разными классами лимфоцитов: за гуморальный иммунитет ответственны В-лимфоциты, за клеточный — Т-лимфоциты. У животных с удаленным в раннем возрасте тимусом нарушаются, однако, не только клеточные иммунные реакции, но и понижается способность к выработке антител. Это связано с тем, что некоторые Т-клетки «кооперируются» с В-клетками в процессе формирования гуморального иммунитета.
Механизм иммунного ответа. До стимуляции антигеном («в покое») Т- и В-лимфоциты морфологически мало различимы. Отдифференцировать их можно либо путем выявления иммуноглобулинов — рецепторов на поверхности В-лимфоцитов, либо путем определения рецепторов к бараньим эритроцитам на поверхности Т-лимфоцитов (реакция образования «эритроцитарных розеток»).
Рис. Схема участия Т- и В-лимфоцитов в клеточном и гуморальном иммунитете.
Под влиянием антигена происходят пролиферация и дифференцировка и тех и других клеток. Активированные Т-клетки трансформируются в лимфобласты, которые дают начало нескольким субпопуляциям клеток (рис. 159). Среди них активные Т-лимфощпы-«киллеры» («убийцы»), Т-лимфоцнты-супрессоры, подавляющие иммунный ответ, Т-лимфоциты-хелперы, интегрирующие иммунный ответ путем кооперации с В-лимфоцитами при выработке антител или путем стимуляции Т-клеток-киллеров. Все эти Т-клетки-партнеры обладают одинаковыми антигенными рецепторами и одинаковыми антигенами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). Последние представляют собой мембранные гликопротеиды клеток, обеспечивающие их иммунологическую совместимость.
Активированные Т-лимфоциты всех популяций выделяют также растворимые факторы (лимфокины), которые регулируют проявление клеточного иммунитета (супрессию, кооперацию, приобретение специфических свойств Т-лимфоцитами) и активируют фагоцитарную активность макрофагов. Примерами лимфокинов могут служить глюкопротеид интерлейкин, стимулирующий рост и пролиферацию Т-лимфоцитов, и белок интерферон, подавляющий размножение вирусов и одновременно усиливающий фагоцитоз.
Все проявления функциональных особенностей отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов можно наблюдать in vitro, воздействуя на них особыми белковыми веществами — лекгинами, обладающими митогенной активностью.
Активированные антигеном В-лимфоциты становятся затем продуцентами антител. При первом контакте с антигеном происходит их начальная активация, или сенсибилизация. Некоторые из дочерних клеток превращаются в клетки иммунологической памяти, другие оседают в периферических лимфатических органах. Здесь они превращаются в плазматические клетки, обладающие хорошо развитым гранулярным эндоплазматическим ретикулумом. Плазматические клетки при участии Т-лимфоцитов-хелперов начинают вырабатывать антитела, которые выделяются в плазму крови.
Клетки иммунологической памяти не дают первичного иммунологического ответа, но при повторном контакте с тем же антигеном легко превращаются в клетки, секретирующие антитела. Схема опыта, подтверждающего ответственность именно лимфоцитов за узнавание чужеродных антигенов, приведена на рисунке. Облучение животных гамма-лучами приводит к гибели лимфоцитов; иммунный ответ на введение антигена у таких животных отсутствует. У облученного животного, получившего лимфоциты от нормального донора той же инбредной линии, реакция на антиген восстанавливается. У облученного животного, получившего другие (нелимфоцитарные) клетки от нормального донора, иммунный ответ не восстанавливается.
47 Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.
Содержание
[убрать]
1 Сущность и классификация
2 Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов
3 Литература
4 Примечания
Сущность и классификация[править | править вики-текст]
Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.
Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод являетсянеконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.
Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты,цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.
Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:
Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антигенконкурируют за связь с иммобилизованным антителом. К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена. Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель. Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена. Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям.[1] Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.
Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов[править | править вики-текст]
В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:
Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;
Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.
Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.
Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.
Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам).
Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% специфичностью при высокой чувствительности.
На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.
Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.
Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.
В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.