10. Виявлення Listeria monocytogenes у реакції наростання титру фага (рнф)

Реакція наростання титру фага - швидкий специфічний метод виявлення лістерій, що забезпечує виявлення збудника в досліджуваному матеріалі без виділення культури і може бути використана як додатковий метод для виявлення L. monocytogenes у харчових продуктах (при проведенні протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні).

РНФ заснована на властивості індикаторного бактеріофага строго специфічно розмножуватися в клітинах гомологічного мікроба. Розмноження бактеріофага супроводжується збільшенням кількості його часток і підвищенням титру.

У реакції застосовують лістеріозні бактеріофаги L2A і L4A. Штами L.monocytogenes I (9-127) і II (9-72) серогруп. Поживні середовища з 0,5 % глюкози: 1,5 % МПБ, і 0,7 % МПА.

При постановці РНФ із пробами харчових продуктів зважують 25 г досліджуваного матеріалу, подрібнюють, поміщають у колбу ємністю 1 дм³ і додають 250 см³ МПБ. Суміш протягом 5-10 хв. струшують, потім 9 см³ переносять у бактеріологічну пробірку № 1 (дослід).

Бактеріофаги використовують у робочому розведенні (10 000 фагових корпускул у 1 см³). Для цього їх розчиняють у МПБ до вихідного об’єму, зазначеного на етикетці ампули, а потім на МПБ окремими піпетками роблять п'ять послідовних десятикратних розведень (в останньому розведенні титр бактеріофага складе 1 х 10⁴).

Суміш фагів готують шляхом змішування рівних об’ємів фагу L2A і L4A у робочому розведенні.

Для контролю титру бактеріофага, (ставлять один на групу аналізів), проведених одночасно, у пробірку № 2 (контроль) вносять 9 см³ МПБ.

У пробірки № 1 і 2 вносять по 1 см³ суміші фагів в робочому розведенні і витримують їх протягом 16-24 год. при кімнатній температурі, після чого в пробірки додають по 1 см³ хлороформу. Вміст ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 30-40 хв. Хлороформ осідає на дно, надосадову рідину піддають подальшим дослідженням.

При використанні суміші фагів з дослідної і контрольної пробірок (№ 1 і 2) беруть по 0,2 см³ і переносять по 0,1 см³ у дві пробірки, що містять по 0,9 см³ МПБ (один ряд для виявлення фагу L2A, а другий - L4A), а потім з кожної пробірки готують ще одне десятикратне розведення.

Готують суспензії штамів I і II серогруп за стандартом мутності 10 од. шляхом розведення добової агарової культури у фізіологічному розчині. В усі пробірки з розведеним матеріалом додають по 0,1 см³ суспензії штаму 1 серогрупи для виявлення фагу L2A або штаму II серогрупи для виявлення фагу L4A.

Вміст пробірок засівають методом агарових шарів за Граціа. Для цього напередодні дня дослідження в чашки Петрі розливають по 10 см³ 1,5 % МПА; Якщо МПА розливають у день дослідження, то поверхню агару попередньо підсушують протягом 40-50 хв. при (37±1)⁰С або 2 год. при кімнатній температурі. Для другого шару використовують розплавлений і охолоджений до (48-50) °С 0,7% МПА, який варто використовувати протягом години, тому що пізніше він набуває желеподібної консистенції і непридатний для дослідження. У пробірки піпеткою вносять по 2,5-3 см³ розплавленого й охолодженого до 48-50 °С 0,7 % МПА. Вміст швидко і ретельно перемішують обертанням пробірки між долонями і виливають у чашку Петрі. Суміш легким погойдуванням чашки рівномірно розподіляють другим шаром на поверхні 1,5%-ного МПА. Чашки залишають на рівному місці на 20-30 хвилин (до застигання 0,7 % МПА), потім перевертають і інкубують при кімнатній температурі.

Облік реакції проводять через 16—24 год. інкубації посівів.

У дослідних пробах і контролі титру фага підраховують число негативних колоній у всіх чашках. Негативні колонії - округлі, добре помітні на тлі бактеріального росту, прозорі ділянки, що утворяться в результаті лізису бактерій.

При обліку результатів порівнюють кількість негативних колоній на чашках відповідних розведень.

Результати реакції оцінюють за збільшенням титру бактеріофага (кількості негативних колоній):

• збільшення кількості негативних колоній у пробі, що досліджується, відносно контролю в 5 і більше разів (хоча б по одному з розведень) оцінюється як позитивний результат, менше, ніж у 5 разів - негативний;

• суцільний лізис або лізис з острівцями оцінюється як позитивний результат.

При одержанні позитивного результату РНФ дають висновок, що в досліджуваному матеріалі (пробі) виявлені бактерії роду Listeria.